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【目的】肺癌是世界上发生率与死亡率最高的恶性肿瘤,根据病理学特征,肺癌可进一步分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)与小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),其中NSCLC约占肺癌总数的80-85%。肺癌通常具有高侵袭转移能力,这也是其临床预后差及死亡率高的主要原因之一。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境的重要组成之一,在肿瘤的发生和发展中起重要作用。微小RNA(micro RNAs,miRNAs)是一大类长度为18-22个核苷酸的非编码RNA,其可以在转录及翻译水平抑制靶基因的表达。大量研究证实miRNAs广泛参与肿瘤进程的调控;同时miRNAs在CAFs中也起重要作用。本研究的目的是探索miR-101减弱CAFs促NSCLC细胞侵袭迁移作用及抑制NSCLC细胞侵袭迁移的分子机制。【方法】一.体外研究:1.利用临床样本建立成纤维细胞系:采集临床肺癌手术样本,从中分离并鉴定CAFs和正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)。2.检测miR-101在各种细胞中的表达水平:运用实时定量PCR(Quantitative realtime-PCR,q RT-PCR)检测NFs、CAFs及NSCLC细胞系中miR-101的表达水平。3.研究CAFs条件培养基对NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响:在DMEM-F12培养基中培养NFs和CAFs并收集条件培养基(conditionedmedium,CM)。用CAF-CM和NF-CM培养NSCLC细胞。通过CCK8实验、划痕愈合实验和transwell小室实验分别评价CAF-CM和NF-CM对NSCLC细胞系(A549、H1299和H661)增殖、迁移与侵袭能力的作用;运用Western blotting检测NSCLC细胞中上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)相关标志物(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)和转移相关基因MMP9和TWIST1表达水平的变化。4.研究CAFs中miR-101对NSCLC细胞增殖、侵袭与迁移能力的影响:在CAFs细胞中转染miR-101 mimics或inhibitor来过表达或抑制miR-101。收集转染24h后的CAF-CM处理NSCLC细胞。通过CCK8实验、划痕愈合实验和transwell小室实验检测调控miR-101表达水平后的CAF-CM对NSCLC细胞的增殖、迁移与侵袭能力的影响。运用Western blotting和q RT-PCR检测NSCLC细胞中EMT相关标志物及转移相关基因的表达水平变化,以及AKT/e NOS信号通路的变化。5.研究miR-101对CAFs活化的影响:通过Western blotting和q RT-PCR检测转染miR-101 mimics或inhibitor后CAFs中成纤维相关基因N-cadherin,Vimentin和α-SMA的表达水平变化。6.研究NSCLC细胞中miR-101对NSCLC细胞侵袭迁移能力的影响。在A549细胞中转染miR-101 mimics或inhibitor来过表达或敲低miR-101。通过划痕愈合实验和transwell小室实验检测调控miR-101的表达水平后的A549细胞的迁移和侵袭能力。运用Western blotting检测A549细胞中EMT相标志物表达水平变化,以及ERK信号通路的变化。7.筛选并验证miR-101的靶基因:通过Mi RTar Base及Target Scan网站预测miR-101潜在的靶基因,进一步筛选出血管内皮生长因子A(vascularendothelial growth factor A,VEGFA)及成纤维细胞生长因子2(fibroblastgrowth factor 2,FGF2)作为候选靶基因。构建带有VEGFA及FGF2基因的3′-UTR区域序列的双荧光素酶报告基因质粒,并进行双荧光素酶报告基因实验验证miR-101与其靶基因3′-UTR的结合情况;通过Western blotting和q RT-PCR检测过表达或敲低miR-101后CAFs中VEGFA和A549中FGF2的m RNA和蛋白水平的变化。8.研究VEGFA在miR-101对NSCLC细胞影响中的作用:收集转染miR-NC和miR-101的CAF-CM并处理NSCLC细胞,同时向培养体系中加入VEGFA的中和抗体(ANTI)或重组蛋白(VEGFA)。通过CCK8实验、划痕愈合实验、transwell小室实验检测NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,通过Western blotting和q RT-PCR检测NSCLC细胞中EMT相关标志物和转移相关基因的表达水平及AKT/e NOS信号通路变化。9.研究FGF2在miR-101对A549影响中的作用:构建FGF2表达质粒。向A549中共转染miR-101 mimics和FGF2,通过划痕愈合实验和transwell小室实验检测FGF2对A549细胞迁移和侵袭能力的影响,通过Western blotting检测A549细胞中EMT相关标记物及ERK信号通路中相关蛋白的表达水平。二.体内研究:裸鼠体内实验:运用慢病毒,在CAFs中过表达miR-NC和miR-101,建立稳定表达miR-101的细胞株:CAF/miR-NC和CAF/miR-101。动物实验分组:A549-luc细胞单种,CAF/miR-NC+A549-luc混种,CAF/miR-101+A549-luc混种。每周进行一次活体荧光信号采集,检测过表达miR-101的CAFs在体内对肺癌生长的影响。【结果】1.miR-101在CAFs及NSCLC细胞系中均低水平表达。2.NFs与CAFs均促进NSCLC细胞的增殖和侵袭迁移,且CAFs的促进作用更强。3.在CAFs中过表达miR-101后CAFs中的N-cadherin,Vimentin和α-SMA的表达水平降低;过表达miR-101后的CAF-CM可以抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭迁移,且NSCLC细胞内的AKT/e NOS通路被抑制。4.在A549细胞中过表达miR-101,A549细胞的EMT和侵袭迁移能力减弱,ERK信号通路被抑制。5.VEGFA和FGF2是miR-101的靶基因。6.与CAF/miR-NC-CM相比,在CAF/miR-NC-CM中加入VEGFA中和抗体组的NSCLC细胞的增殖及侵袭迁移能力均减弱,而加入重组蛋白组的增殖与侵袭迁移能力均增强;且加入重组蛋白可逆转CAF/miR-101-CM对增殖与侵袭迁移的抑制作用;CAFs中的miR-101可通过减少VEGFA的分泌抑制AKT/e NOS信号通路。7.在A549细胞中过表达FGF2可促进A549细胞的侵袭迁移;在A549细胞中共过表达miR-101和FGF2组侵袭迁移能力比单独过表达FGF2减弱,比单独过表达miR-101组增强;A549细胞中的miR-101可通过减少FGF2的表达抑制ERK信号通路。8.动物实验结果显示:CAFs促进肿瘤的体内生长,而在CAFs中过表达miR-101可减弱CAFs促进肿瘤体内生长的作用。【结论】1.CAFs与NFs均促进NSCLC细胞的增殖与侵袭迁移,其中CAFs的促进作用更强。2.CAFs促进NSCLC细胞的增殖与侵袭迁移作用与CAFs中miR-101的低水平表达相关。CAFs通过降低miR-101的表达使其靶基因VEGFA的表达升高,激活NSCLC细胞的AKT/e NOS信号通路,促进NSCLC的增殖与侵袭迁移。3.NSCLC细胞的侵袭转移与细胞中miR-101低水平表达有关。NSCLC细胞中低水平的miR-101使其靶基因FGF2表达增高,激活ERK通路,增强NSCLC细胞的侵袭和迁移能力。4.CAFs促进肿瘤的体内生长,在CAFs中过表达miR-101可有效抑制CAFs促进肿瘤体内生长的作用。