背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是目前临床上常见的致死率较高的疾病之一,现有的治疗方法无法从根本上弥补由急性心肌梗死导致的实质性损伤。人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)有多向分化的潜能,将有望成为心肌梗死治疗的新途径,但其具有潜在的致瘤性且难以保存,无法普及。早期研究认为,hUC-MSCs治疗心肌梗死时增殖分化为心肌细胞以弥补受损组织,但后期研究发现其主要是通过旁分泌对心肌梗死起治疗作用。hUC-MSCs分泌的外泌体(Exosomes)对心肌梗死有确切疗效,同时有研究表明P4代hUC-MSCs对心梗的疗效最好,P7代开始疗效变差,但关于不同代数hUC-MSCs源性的Exosomes对心肌梗死疗效是否有差异没有报道,为明确Exosomes是否为hUC-MSCs发挥作用的重要因子,以进一步探究不同传代数hUC-MSCs是否通过旁分泌机制而影响心肌梗死的疗效,本课题取P4与P7代hUC-MSCs源性的Exosomes作用于心肌梗死大鼠观察其对心肌梗死的疗效差异,并进一步比较两者的蛋白含量与miRNA的不同,为进一步探索Exosomes治疗心肌梗死的机制提供科学依据。目的:研究P4与P7代hUC-MSCs来源的Exosomes对心肌梗死的疗效差异,为临床治疗心肌梗死提供一定的实验数据。方法:1、第一部分:1)采用组织块贴壁法分别得到P4与P7代hUC-MSCs,倒置显微镜下观察其形态;2)成脂、成骨诱导分化鉴定P4与P7代hUC-MSCs分化潜能;3)流式细胞术分别鉴定P4与P7代hUC-MSCs表面标志物。2、第二部分:1)使用超高速差速离心法、Exo-Quick试剂盒法、Isolation试剂盒法提取hUC-MSCs来源的Exosomes;2)透射电子显微镜下对三种方法所得Exosomes分别进行形态学鉴定;3)利用粒径分析仪对三种方法提取到的Exosomes分别进行粒径检测;4)BCA法对三种方法提取的Exosomes分别进行蛋白浓度测定;5)SDS-PAGE凝胶电泳对三种方法提取的Exosomes中蛋白进行半定量分析;6)Western blot法对三种方法提取的Exosomes的标志蛋白进行鉴定。3、第三部分:1)使用超高速差速离心法分别提取P4与P7代hUC-MSCs来源的Exosomes,称为P4/Exo与P7/Exo;2)经冠状动脉左前降支结扎法建造大鼠AMI模型,实验动物分为四组:假手术组+生理盐水(Sham+NS)、心肌梗死+生理盐水组(AMI+NS)、心肌梗死+P4代hUC-MSCs来源的Exosomes组(AMI+P4/Exo)、心肌梗死+P7代hUC-MSCs来源的Exosomes组(AMI+P7/Exo);3)结扎后,采用心肌注射法对AMI+P4/Exo组与AMI+P7/Exo组移植等量P4/Exo与P7/Exo,AMI+NS组与Sham+NS组分别注射与前两组等体积的NS;4)使用超声心动图分别对结扎后与移植治疗一周后的四组实验动物进行心功能检测,检测指标为:左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、射血分数(EF)及短轴缩短率(FS);5)采用TTC(2,3,5,-氯代三苯基四氮唑)染色法对移植治疗一周后,超声心动图检测完毕的四组实验动物进行心脏染色,使用Image Pro plus 60软件进行心肌梗死面积的计算;6)使用流式细胞仪对移植一周后,超声心动图检测完毕的四组实验动物的心肌细胞进行凋亡检测;7)使用Western blot法对移植一周后,超声心动图检测完毕的四组实验动物的心肌组织的凋亡蛋白进行检测;8)利用RT-qPCR(实时荧光定量多聚核苷酸链式反应)对P4/Exo与P7/Exo中的miRNA21的相对表达量进行检测。结果:1、P4代hUC-MSCs低倍镜下呈紧密头发丝样旋涡状排列,P7代hUC-MSCs较P4代排列紊乱;P4、P7代hUC-MSCs成脂成骨诱导过程中可观察到脂滴与钙结节,且P4比P7代hUC-MSCs的脂滴与钙结节多;流式检测P4与P7代细胞CD90、CD44、CD105均呈强阳性,CD14、CD34、CD45均呈阴性,表达率无统计学差异(P>0.05)。2、超高速差速离心法、Exo-Quick试剂盒法及Isolation试剂盒法均可提取到Exosomes;电镜下均可观察到30-200nm的圆形或椭圆形膜性小囊泡,超高速差速离心法获得的Exosomes形态最为典型;经粒径分析仪检测,超高速差速离心法所得的囊泡粒径为86.65±0.96nm,Exo-Quick试剂盒法所得囊泡粒径是187.95±3.22nm,Isolation试剂盒法所得囊泡粒径是47.55±1.29nm,三种方法所得囊泡均值在30-200nm范围内;经Western blot法检测三种方法提取到的Exosomes标志蛋白CD9、CD63、CD81均成阳性,超高速差速离心法提取到的Exosomes标志蛋白相对表达量最高,与Exo-Quick试剂盒法提取到的Exosomes相比,差异具有统计学意义(P<0.05),与Isolation试剂盒法提取到的Exosomes面标志蛋白相对表达量相比差异有统计学差异(P<0.01),Exo-Quick试剂盒法与Isolation试剂盒法提取到的Exosomes的表面标志蛋白相对表达量相比,差异也具有统计学意义(P<0.01);蛋白浓度分别是2.78±0.13mg/ml、2.14±0.13mg/ml、1.38±0.11mg/ml,超高速差速离心法提取到的Exosomes蛋白浓度与Exo-Quick试剂盒法提取到的Exosomes蛋白浓度相比,差异具有统计学意义(P<0.05),与Isolation试剂盒法提取到的Exosomes蛋白浓度相比差异有统计学差异(P<0.01),Exo-Quick试剂盒法与Isolation试剂盒法提取到的Exosomes的蛋白浓相比,差异也具有统计学意义(P<0.01);经凝胶电泳分析蛋白主要富集在25-55kD之间及130kD以上。3、心肌梗死模型大鼠心电图出现ST段抬高,心尖部变白;超声心动图显示,模型建立后,AMI+NS组、AMI+P4/Exo组、AMI+P7/Exo组比Sham+NS组的LVIDd与LVIDs高,EF与FS低,且Sham+NS与其他三组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),移植治疗一周后,AMI+NS组比AMI+P4/Exo组、AMI+P7/Exo组,LVIDd、LVIDs较高,EF与FS较低,差异具有统计学意义(P<0.05),AMI+P7/Exo组比AMI+P4/Exo组,LVIDd、LVIDs较高,EF与FS较低,差异具有统计学意义(P<0.05);TTC法测得的心肌梗死面积四组均不同,Sham+NS组为0%、AMI+NS组为48.44±0.81%、AMI+P4/Exo组为28.24±1.31%、AMI+P7/Exo组35.73±0.80%,AMI+NS组比AMI+P4/Exo组、AMI+P7/Exo组梗死面积较大,差异具有统计学意义(P<0.05),AMI+P7/Exo组比AMI+P4/Exo组梗死面积大,差异具有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测凋亡,Sham+NS组凋亡率为3.61±0.74%、AMI+NS组为46.77±0.51%、AMI+P4/Exo组凋亡率为26.39±0.92%、AMI+P7/Exo组为35.38±1.37%,各组均不同,AMI+NS组分别与AMI+P4/Exo组、AMI+P7/Exo组相比及AMI+P4/Exo组与AMI+P7/Exo组相比,均具有统计学差异(P<0.05);Western blot检测相关凋亡蛋白显示AMI+NS组Caspase-3表达高于AMI+P7/Exo组及AMI+P4/Exo组,而Bcl-2在Sham+NS组表达高于AMI+P4/Exo组、AMI+P7/Exo组及AMI+NS组。4、使用超高速差速离心法提取P4与P7代hUC-MSCs来源的Exosomes,透射电镜下可观察到均匀、托盘样膜性椭圆囊泡,P7/Exo数量比P4/Exo数量少;粒径分析仪得到P4/Exo与P7/Exo的粒径分别为98.33±7.65nm、104.68±6.68nm,均在30-200nm范围内;经BCA法测得蛋白浓度分别是2.64±0.12μg/μl、2.45±0.13μg/μl,差异无统计学意义(P>0.05);相关表面标志性蛋白CD9、CD63均成阳性,P4/Exo比P7/Exo的CD9与CD63相对表达量高,且差异具有统计学意义(P<0.05);P4/Exo与P7/Exo中miRNA21相对表达量为2.37±0.04、1.89±0.05,用独立样本t检验分析,差异有统计学差异(P<0.01)。结论:1、经超高速差速离心法、Exo-Quick试剂盒法及Isolation试剂盒法比较,超高速差速离心法提取到的Exosomes质量最好;2、成功建立了大鼠AMI模型,P4代比P7代hUC-MSCs来源的Exosomes对心肌梗死的疗效好,提示Exosomes是hUC-MSCs发挥作用的重要因子;3、P4与P7代hUC-MSCs来源的Exosomes相比,miRNA21的变化有统计学意义,提示miRNA21是Exosomes发挥作用的重要因子。