Stx2e毒素酶活性位点突变体毒素生物学性及免疫保护性的研究

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猪水肿病(Edema disease of swine,ED)是仔猪的一种急性致死性传染病,主要由某些定殖于小肠的特定血清型、产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)引起,又称为肠毒血症。临床上该病主要特征是胃大弯、肠系膜和脑部水肿,同时还常伴有共济失调、惊厥或麻痹等神经症状。引起猪水肿病的致病因素复杂,主要的毒力因子是F18菌毛和志贺毒素Ⅱ型变异体e亚型(Stx2e)。  大肠杆菌pET-ABmu是由本实验室构建的可以同时表达Stx2eA亚单位(突变体)和Srx2eB亚单位的重组菌,在37℃、 IPTG浓度为0.5 mmol/L时表达最大量的重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB,重组蛋白主要存在于沉淀中,蛋白分子量分别约为35kDa和7.5 kDa。重组蛋白已经过Westem-blot证实抗原性良好。重组蛋白经过透析纯化后,经颈部肌肉注射免疫仔猪,免疫后第7d即可产生抗体,在第42 d抗体达到最高,猪血清抗体效价可达到1∶5120。在Vero细胞水平上利用免疫猪血清做了对Stx2e粗提物的的中和试验,结果表明免疫猪血清对Stx2e粗提物反应后的中和滴度为26,说明免疫猪血清对Stx2e有较强的抑制作用。  用纯化的重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作为免疫原,腹腔注射免疫ICR小鼠,以验证重组蛋白对于小鼠的毒性和免疫原性,免疫结束后用致死剂量的Stx2e粗提毒素进行攻毒,观察重组蛋白对于小鼠的免疫保护性效果。结果表明,腹腔注射重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB的小鼠无任何症状,表明重组蛋白对小鼠无毒性作用,用最小致死量(MLD)的Stx2e粗提物的攻毒试验表明,腹腔注射重组蛋白能够刺激小鼠机体产生有效的保护性抗体,且对小鼠的平均免疫保护率能够达到93%以上,且小鼠在2个MLD剂量攻毒时的平均免疫保护率能够达到90%,表明重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB免疫小鼠能够产生良好的免疫保护效果。  用纯化的重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作为免疫原,经颈部肌肉注射免疫三批次的35日龄的仔猪,以验证重组蛋白对于仔猪的免疫保护效果,免疫结束后用致死剂量的Stx2e粗提毒素进行攻毒,观察重组蛋白对于仔猪的免疫保护性效果。结果表明,颈部肌肉注射重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB免疫仔猪后,仔猪未出现异常症状,表明重组蛋白对仔猪无影响;在用致死量的Stx2e粗提物的攻毒试验中,试验组攻毒后有1头发病,其余未发病,发病率为8.3%;对照组4头全部发病,发病率100%,对照组仔猪死亡3头,死亡率为75%,表明颈部肌肉注射重组蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB免疫仔猪能够刺激仔猪机体产生有效的保护性抗体,对仔猪起良好的免疫保护效果。
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