再生丝素蛋白/膀胱脱细胞基质纤维毡及水凝胶的制备与表征

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再生丝素蛋白(RSF)是一种天然的高分子材料,不仅具有一定的力学性能,而且具有良好的生物相容性、生物可降解性以及对人体几乎没有炎症反应等优异性能。静电纺丝工艺制备的丝素蛋白(SF)支架,保留了SF的优良特性,且具有比表面积大、孔隙率高,纤维精细度和均一度高等特点,高度地模仿了细胞外基质结构,因此在生物组织工程中有广泛的应用潜力。为了增加SF纤维毡的生物活性,人们曾添加外源性生长因子,以促进细胞的增殖与黏附。与外源性生长因子相比,内源性生长因子来自于生物体,更有利于促进细胞的生长。膀胱脱细胞基质(BAM)是由胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白、糖蛋白、生长因子等组成的天然生物材料,具有良好的生物相容性和生物可降解性。本论文以BAM/RSF混合水溶液作为纺丝液进行静电纺丝,利用BAM内源性生物信号因子来增加RSF/BAM纤维毡的生物活性。在此基础上,在纺丝液中引入具有高粘弹性、良好生物相容性和降解性的透明质酸(HA),以提高RSF/BAM溶液的静电纺丝可纺性。通过扫描电子显微镜(SEM)、广角X射线衍射(WAXD)、傅里叶红外光谱仪(FTIR)、差示扫描量热仪(DSC)对纤维毡的形貌、结构和性能等进行表征,通过ELISA试剂盒测定RSF/BAM/HA纤维毡中生长因子的存在及缓释曲线,通过体外培养猪髋血管内皮细胞(PIECs)考察了RSF/BAM/HA纤维毡的生物相容性。分别考察了纺丝液BAM浓度、纺丝液溶质总浓度对纺丝液流变行为、纤维毡形貌、构象、热性能以及生物性能的影响。研究表明,对于RSF/BAM二元共混溶液体系,随着BAM含量的增加,纺丝液粘度、表面张力下降,电导率增加,但表面张力与电导率的变化不大,粘度下降较为明显。随着BAM含量的增加,RSF/BAM纤维毡的纤维直径减小,纤维不均匀程度增加,甚至出现断裂趋势。相对于RSF/BAM纤维毡,RSF/BAM/HA纤维毡的形貌有所改善,纤维直径较均匀,纤维表面较为光滑。当纺丝液溶质总浓度由22.0 wt%增加到24.5 wt%时,纤维致密程度增加,纤维直径变小;继续增大纺丝液溶质总浓度,纤维直径变化不大,纤维直径分布较为均匀。纺丝液溶质总浓度对RSF/BAM/HA纤维毡的构象、结晶度、热性能影响有限。水凝胶为三维网状结构,具有尺寸可变、强度可调等优点,生物大分子水凝胶还具有良好的生物相容性和生物可降解性,在组织工程应用广泛。本论文在BAM经过消化、溶解后且生长因子仍然保存的基础上,制备了不同浓度的BAM水凝胶。通过哈克流变仪、微流变仪、SEM、FTIR、DSC对BAM水凝胶在凝胶前后流变性能、结构性能的变化以及其凝胶点进行表征,探讨了BAM浓度对BAM水凝胶性能的影响。通过ELISA试剂盒测定水凝胶中生长因子的存在及缓释曲线,通过体外培养PIECs考察了BAM水凝胶的生物相容性。结果表明,浓度为4 mg/m L与6 mg/m L的预凝胶溶液(BAM 4-P,BAM 6-P)的凝胶时间分别为3.95±0.07 min和23.77±0.05 min,浓度为8 mg/m L的预凝胶溶液(BAM 8-P)在测定时间内并没有发生凝胶。与预凝胶溶液相比,BAM凝胶的红外光谱在985 cm-1与870 cm-1处出现了新的吸收峰,表明凝胶过程中发生了化学反应或相互作用。与预凝胶溶液相比,BAM水凝胶的变性温度升高,热稳定性提高,其中浓度为4 mg/m L的水凝胶(BAM 4-G)的热变性温度比浓度为6 mg/m L的水凝胶(BAM 6-G)高。通过ELISA测试,血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍化生长因子(PDGF-BB)和角化细胞生长因子(KGF)都仍存在于RSF/BAM/HA纤维毡与BAM水凝胶中。对于RSF/BAM/HA纤维毡,这三种生长因子都能持续缓释达16 d以上,其中VEGF缓释总量最多,缓释速率最快。对于BAM水凝胶,这三种因子都存在突释现象;在前2天,缓释量迅速增加,然后逐渐下降,最后趋于稳定平缓;BAM 4-G中三种因子的缓释量均多于BAM 6-G。RSF/BAM/HA纤维毡与BAM水凝胶中所存在的生长因子能明显提高支架的生物相容性,促进细胞的生长。与对照组相比,PIECs在RSF/BAM/HA纤维毡以及BAM水凝胶上的生长形态更好。此外,细胞不仅可以粘附在支架表面上生长,还可以深入到支架材料的内部生长,更有利于组织的修复。
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