维吉尼亚链霉菌IBL14中细胞色素P450的鉴定与功能分析

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维吉尼亚链霉菌IBL14是一株从制药厂附近的污泥中筛选得到的,它能够有效的转化和降解甾醇类化合物,包括:孕酮、皮质醇和胆固醇等。本实验室研究IBL14对薯蓣皂苷元的转化和降解作用,产生11种新的代谢产物和发现了2条新的代谢通路:薯蓣皂苷元C25羟基化和C6双甲氧基化。在这个代谢通路中细胞色素P450起到了重要的作用,为了研究维吉尼亚链霉菌IBL14中细胞色素P450的结构与功能,首先对链霉菌IBL14进行了全基因组测序,测序结果表明链霉菌IBL14的全基因组约80Mb,GC含量高于70%。在全基因注释中预测得到33个细胞色素P450基因,分属于13个细胞色素P450家族,主要分在CYP105、CYP107、CYP191和CYP197家族。在全基因组测序之前,利用分子遗传学技术克隆出了细胞色素P450单氧化酶fcpc基因,它能够催化薯蓣皂苷元C25位羟化,该基因序列与测序预测的svh01序列一致。   IBL14中33个CYPs通过与Streptomyces griseussubsp.Griseus NBRC 13350、Streptomyces avermitilis和Streptomyces sp.Mg1全基因组中的细胞色素P450基因序列比对,表明IBL14与Streptomyces sp.Mg1的遗传关系最近;在这四株菌中CYP105、CYP107和CYP157各家族成员相似性较高;svu001的可能是CYP家族中新发现的成员,在Genbank中仅与Streptomyces sp.Mg1中的一条基因序列有60%的一致性,与其它收录的序列的一致性低于25%。   在预测的所有序列中,经过同家族成员比对,表明几乎所有序列都有典型的细胞色素P450保守序列的结构域:在I螺旋中有保守的氨基酸残基GXXT,螺旋K中保守的EXXR模块,以及保守的半胱氨酸疏水性口袋域。   目前还预测得到IBL14基因组中有9个铁氧还蛋白基因和3个铁氧还蛋白还原蛋白基因。它们与IBL14CYPs的关系:有3个P450基因与铁氧还蛋白基因成簇;svu020与铁氧还蛋白还原蛋白基因和铁氧还蛋白基因两个基因成簇;还有部分CYPs与调控基因和其它功能基因成簇存在。   目前,已经完成了基因svh01在大肠杆菌中的克隆表达,重组菌能够代谢薯蓣皂苷元和炔雌醇;svu022在大肠杆菌中的克隆和枯草杆菌中的表达已经完成。这两种蛋白质都是可溶性的,分子量分别是44KD和45KD。
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