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目前,由于植被利用及人为活动造成的土壤重金属污染日益严重,植物修复是改善重金属污染土壤环境的新兴技术。铜既是土壤重金属污染的主要污染物之一,又是植物维持正常生命活动所需的微量元素。为了适应环境中的铜水平,植物已经形成了复杂的调控网络以维持细胞铜稳态,铜伴侣蛋白是实现此机制的重要参与者。本研究在课题组前期工作的基础上,构建了小黑杨(Populus simonii×us nigra)铜伴侣蛋白基因PnCCH5、PnCCH10、PnCCH19的植物表达载体。利用构建的PnCCH10基因的表达载体,通过蘸花法遗传转化拟南芥野生型植株及cch突变体植株;通过农杆菌介导的叶盘法遗传转化小黑杨,分别获得了转PnCCH10基因的拟南芥和小黑杨植株,并进行了相关分子生物学和生理指标鉴定。主要研究结果如下:(1)利用已经克隆的小黑杨PnCCH5(MF977407.1)、PnCCH10(MF977410.1)和PnCCH19(MF977413.1)基因,通过酶切连接法构建了拟南芥过量表达载体pCAMBIA1302-PnCCHs,电击转化农杆菌菌株GV3101后获得了含有重组质粒的农杆菌菌株。同时,构建了 PnCCH5、PnCCH10及PnCCH19基因的小黑杨过量表达载体pROKII-PnCCHs,电击转化农杆菌菌株EHA105后获得了含有重组质粒的农杆菌菌株。(2)利用构建的PnCCH10基因的拟南芥过量表达载体,通过蘸花法遗传转化拟南芥野生型及cch突变体植株。利用潮霉素进行筛选并获得T2代植株。提取两种类型T2代转基因植株的基因组DNA,通过PCR方法鉴定后获得了 9个PnCCH10-WT转基因株系和10个PnCCH10-cch转基因株系。收取鉴定后的转基因植株纯合种子并保存。(3)利用构建的PnCCH10基因的小黑杨过量表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法遗传转化小黑杨野生型植株。利用含有卡那霉素的培养基进行筛选后获得阳性植株。提取阳性转基因植株的基因组DNA,利用特异性检测引物进行PCR鉴定,获得了 16个PnCCH10转基因小黑杨株系。利用qRT-PCR方法鉴定转基因株系中PnCCH10基因的表达情况,挑选出5个PnCCH10基因高表达的转基因株系进行生理指标测定。(4)利用含有正常浓度铜离子(0.5 μmol/L)和高浓度铜离子(10 μmol/L)的改良1/2霍格兰德营养液水培处理小黑杨野生型和转基因株系幼苗7 d。测定处理植株的丙二醛(MDA)含量,同时测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)酶活等生理指标。结果显示,正常浓度铜离子处理条件下,与野生型对照植株相比,2和13号转基因株系叶片MDA含量显著降低,5号株系根MDA含量显著升高;各转基因株系叶片和根SOD酶活显著升高;3、5、7、13号株系叶片和2、5、13号株系根的POD酶活显著降低;13号株系叶片和3、5、7、13号转基因株系根CAT酶活显著升高。过量铜胁迫处理后,与野生型植株相比,各PnCCH10过表达转基因株系MDA含量和SOD酶活无显著变化;除了7号株系根POD酶活无显著差异之外,其余各转基因株系叶片和根POD酶活均显著下降;除了 5号转基因株系叶片CAT酶活无显著差异之外,各转基因株系根CAT酶活显著降低,叶片CAT酶活显著升高。这些研究结果为进一步鉴定小黑杨PnCCH10蛋白的功能、丰富铜伴侣蛋白CCH在维持杨树细胞铜稳态过程中发挥的作用奠定了试验基础,为培育重金属耐受植物来修复土壤污染提供材料依据。