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棉花基因功能的鉴定和新品种的选育离不开突变体的获得,CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现为实现棉花分子育种提供了强大的技术工具。目前,棉花基因编辑技术体系已经建立并陆续得到升级和改良（CRISPR/Cpf1和单碱基编辑系统）。然而,要实现棉花目标基因的靶向编辑必须要经过转基因,通过组织培养的方法才能获得目标基因突变体。而棉花的遗传转化费时费力,周期长,且受棉花品种基因型的限制,仅有少数几个棉种可以进行有效的遗传转化。针对以上问题,本研究主要开展了两种途径的研究。第一种途径:以棉花花粉作为转基因受体,构建棉花生殖特异性CRISPR/Cas9基因编辑体系,在花粉内部靶向敲除目标基因,然后以突变后的花粉通过授粉的方式获得棉花突变体;第二种途径:建立基于棉花叶皱缩病毒CLCr V介导的基因编辑系统（VIGE）,以超表达Cas9（Cas9-OE）的棉花作为转基因受体,利用拟南芥成花素FT基因将sg RNA长距离运输至棉花顶端分生组织的功能,以期避开组织培养的过程来获得稳定遗传的棉花突变体。验证通过以上两种途径可以避开组织培养,高效获得棉花突变体。主要研究结果如下:1.在棉花TM-1根、茎、叶、花粉、萼片和花瓣6个组织中分析了GhPLIM2b和GhMYB24基因的组织特异性。结果显示:GhPLIM2b基因在棉花花粉中特异表达,而GhMYB24是一个在棉花花粉中表达的基因;进而克隆了GhPLIM2b（1530 bp）和GhMYB24（1435 bp）启动子,并成功构建了GhPLIM2b P::GUS和GhMYB24P::GUS的融合表达载体。瞬时转化棉花花粉GUS组织化学染色结果显示:GhPLIM2b和GhMYB24启动子均能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色,且这两个启动子转录活性无明显差异;使用GhPLIM2b和GhMYB24启动子驱动Cas9基因表达,设计了靶向编辑棉花GhCLA1、GhGGB和GhERA1的编辑载体。突变检测结果显示:GhMYB24P::Cas9和GhPLIM2b P::Cas9编辑载体均可以实现对棉花花粉内源基因的靶向编辑,编辑效率为3.29%-6.45%,且这两个编辑系统编辑效率无明显差异,但存在少数的脱靶现象。由于转化后的大部分花粉已经失去了授粉活力,导致无法以基因编辑的花粉通过授粉的方式获得可遗传基因编辑的后代。本研究证明了GhPLIM2b P::Cas9和GhMYB24P::Cas9编辑体系的有效性,为使用棉花花粉作为转基因受体快速获得棉花突变体提供了有效的基因编辑系统。2.在拟南芥中建立了基于棉花叶皱缩病毒CLCrV介导的VIGE系统,以Cas9-OE拟南芥作为转基因受体,利用CLCr V介导的VIGE系统靶向敲除了拟南芥BRI1、GL2和PDS以及转基因GUS基因,验证了该系统的可行性和高效性;同时,证明了以分生组织高效表达的Pro Yao::Cas9转基因拟南芥作为转基因受体,可以显著提高CLCr V介导的VIGE的基因编辑效率;针对VIGE系统的不足,进一步将102 bp FT m RNA与sg RNA融合去转化Pro Yao::Cas9和Pro35S::Cas9拟南芥,探究利用拟南芥成花素FT基因将sg RNA长距离运输至植物顶端分生组织的功能,以期避开组织培养的过程来获得稳定遗传的突变后代。结果显示:5’端融合了FT m RNA的sg RNA（FT策略）,可以在当代植株中有效实现基因编辑。同时,也可以不经过稳定遗传转化的过程获得可遗传的突变后代,后代发生编辑的效率为4.35%-8.79%。此外,由FT-sg RNA产生的基因编辑的后代中并不存在CLCr V病毒基因组成分。利用FT-sg RNA策略在拟南芥上获得了可遗传给后代的基因编辑,展现了该策略在作物功能基因组学和分子设计育种中具有广阔的应用前景。3.为了扩展CLCrV介导的VIGE体系的应用范围,在棉花中测试了CLCr V介导的VIGE系统的可行性。以Cas9-OE棉花作为转基因受体,利用CLCr V介导的VIGE系统高效地实现了棉花GhPDS和GhCLA1基因的靶向编辑,证明了CLCr V介导的VIGE系统同样适用于棉花;与此同时,CLCr V介导的VIGE系统在棉花中可以同时投送多个sg RNAs,实现了棉花GhPDS和GhCLA1基因的双突变;鉴于FT-sg RNA策略在拟南芥中能够实现可遗传的基因编辑后代,进一步验证该策略在棉花中是否同样适用。结果显示:102 bp的FT m RNA融合到sg RNA的5’同样也能够实现棉花内源基因GhPDS、GhCLA1、GhBsrk1和GhMAPKKK2的靶向编辑;在棉花中CLCr V介导的VIGE系统,在不依赖FT-sg RNA的情况下,仍然可以实现棉花胚珠细胞的基因编辑。且由CLCr V介导的VIGE产生的基因编辑的后代（胚珠）中并不存在CLCr V病毒基因组成分。CLCr V介导的VIGE系统在棉花中的成功应用为棉花生物学研究、大规模构建棉花基因突变体库和实现棉花全基因组水平上的精准遗传改良奠定了重要的技术基础。