研究背景及目的据2012中国卫生年鉴的统计，我国因心血管疾病的死亡率位于各类疾病之前列，在城市为257.41/10万，占总死亡率的19.51%，在农村为128.13/10万，占17.45%。尽管随着溶栓疗法、经皮腔内冠脉介入治疗等的策略优化，心肌梗死的早期死亡率有明显降低，但是，缺血再灌注损伤导致的远期心力衰竭和死亡仍然居高不下，近年来对其有效地防治策略研究越来越被人们重视。氧化应激（oxidative stress, OS）是一种高活性分子产生与机体清除或者修复能力失衡的表现，其通过过氧化物和氧自由基的产生破坏细胞的各组成部分，造成细胞毒性破坏细胞正常的氧化还原状态，直接参与动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、心脏衰竭的发生发展。因此有效降低氧化应激损伤，是早期预防和治疗心肌缺血再灌注减低死亡率的关键策略之一。细胞外超氧化物歧化酶1982年由Marklund等首次发现并命名，是超氧化物歧化酶家族中的一种。超氧化物岐化酶是一种抗氧化酶，它可以将两个自由基歧化为H2O和O2。细胞外超氧化物歧化酶不仅存在于细胞外环境，而且在一些特定的组织如心脏，血管，肺组织，肾脏和胎盘等中高表达，其生理学功能主要是保护大脑、心脏和其他组织免受氧化应激损伤，减少细胞和组织损伤。基因治疗是在1972年首次提出[1]，以基因工程技术为手段，导入目的基因修复异常的基因或使其表达相应的蛋白治疗疾病的一类新型技术。1990年，美国FDA批准首个基因治疗实验治疗重症综合免疫缺陷（severe combinedimmunodeficiency，SCID）[58]。自此，已进行了超过1700项有关基因治疗的临床试验。虽然早期临床失败导致许多对基因治疗的质疑，但近年来治疗视网膜疾病莱伯氏先天性黑朦（retinal disease Leber’s congenital amaurosis）[59-62]，SCID[63]和帕金森氏病[64]等临床试验的成功为基因治疗带来新的希望。研究证实通过直接注射ec-SOD病毒载体过表达ec-SOD可以减少心肌顿抑和梗死面积。但因作用时间较短和直接注射病毒的安全性而限制了其临床应用。本研究拟在体外细胞水平，探讨ec-SOD（extracellular superoxide dismutase，细胞外超氧化物歧化酶）修饰的BMSCs（bone marrow mesenchymal stem cells，骨髓间充质干细胞）对缺氧复氧条件下乳鼠心肌细胞的保护效应以及潜在作用机制，以期找寻找抗心肌氧化应激损伤的新治疗策略。方法第一部分：乳鼠心肌细胞的分离培养鉴定与BMSCs的分离培养鉴定：通过差速贴壁法获得乳鼠心肌细胞，采用cTnI免疫荧光染色鉴定乳鼠心肌细胞的分离效率；通过贴壁法获得BMSCs，通过流式细胞计数鉴定BMSCs的表面标志物。第二部分：观察ec-SOD修饰的BMSCs对H/R条件下CMs（cardiomyocytes，心肌细胞）的保护作用：1.将CMs分为4组：A常氧对照组（不做缺氧复氧干预）；B缺氧对照组（单纯进行缺氧复氧干预）；C条件培养组（将ec-SOD修饰的BMSCs培养48h的培养基加入CMs并进行缺氧复氧干预）；D共培养组（将ec-SOD修饰的BMSCs置于transwell小室中与CMs共培养并进行缺氧复氧干预）；检测1. Elisa法检测ec-SOD修饰的BMSCs分泌ec-SOD蛋白的水平；2. MTT法检测H/R条件下CMs的存活率；3. TUNEL法检测CMs的凋亡率。第三部分：探讨ec-SOD修饰的BMSCs对H/R条件下CMs的保护作用机制：将CM分为4组：A常氧对照组；B缺氧对照组；C条件培养组；D共培养组；检测1. DHE染色检测ROS的含量；2. Western blot检测ec-SOD修饰的BMSCs作用后CMs中p38MAPK和p-p38MAPK表达的变化。结果：1．乳鼠心肌细胞分离培养后第3d，在倒置相差显微镜下可见细胞伸出伪足相互接触交织成网，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，搏动频率多在100/min～120/min；cTnI染色鉴定呈阳性。BMSCs经培养，倒置相差显微镜观察细胞长梭形、成纤维状，排列较紧密；经流式细胞仪鉴定，其表面标志物CD44、CD90阳性、CD34、CD45阴性。2．ec-SOD修饰的BMSCs通过分泌ec-SOD，可明显增加CMs在缺氧复氧损伤后的存活率和减少CMs的凋亡。3．ec-SOD修饰的BMSCs能够明显减少CMs间的ROS含量，进而减少CMs在缺氧复氧损伤后的p38MAPK的磷酸化。结论ec-SOD修饰的BMSCs能够通过减少氧化应激损伤降低p38MAPK的磷酸化，对H/R损伤的CMs产生保护效应。