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近年来,水稻条纹叶枯病在各地爆发流行,给水稻生产造成了严重的损失。该病害是由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的。RSV编码的蛋白主要有外壳蛋白(CP)、病程相关蛋白(SP)、推测与运动相关的蛋白(NSvc4)等。为了逃避寄主的免疫以及自身的繁殖,病毒蛋白与寄主蛋白之间存在着一系列的互作。在蛋白筛选的基础上,本研究是对病毒蛋白NSvc4与水稻蛋白之间的相互作用做进一步的验证研究。本文首先对免疫共沉淀在水稻蛋白筛选上的应用进行探索。一方面,培养水稻悬浮细胞体系,接种病毒之后提取细胞总蛋白,分别用CP、SP抗体进行免疫共沉淀实验;另一方面,经带病灰飞虱传毒之后,提取发病水稻幼苗总蛋白,分别用SP、CP抗体免疫共沉淀水稻蛋白。分别在水稻悬浮细胞水平和水稻植株水平,筛选与RSV CP、SP蛋白存在相互作用的水稻蛋白。在构建水稻文库(武育粳3号和“KT95-418”)的基础上,分别以RSV CP、SP、NSvc4为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统,筛选出一系列与病毒蛋白存在相互作用的水稻蛋白。本文对以RSV NSvc4为诱饵蛋白,在“KT95-418”文库上筛选到的NB8(Heat shock protein DnaJ family protein contains InterPro domain)、NB9(Light regulated Lir1 family protein contains InterPro domain)蛋白作为对象,对它们之间的相互作用,做进一步的验证研究。首先,提取水稻RNA,通过RT-PCR扩增获得了水稻NB8和NB9完整基因,分别将其与酵母双杂交捕获载体pGADT7相连,构建重组子pGAD-NB8、pGAD-NB9。利用酵母双杂交系统验证了NSvc4分别与NB8、NB9蛋白之间的互作情况。结果发现:RSV NSvc4与NB8在三缺平板,四缺平板上均能正常生长。同样,RSV NSvc4与NB9在三缺平板,四缺平板上也均能正常生长。为了进一步说明水稻条纹病毒RSV NSvc4与水稻蛋白NB8,NB9两两之间的互作关系,本研究又选用免疫共沉淀技术进行检测。首先通过PCR扩增获得了融合有HA标签的水稻NB8、NB9基因和融合有c-Myc标签的RSV NSvc4基因,并将其分别插入到植物表达载体pEGAD或pKYLX71:35S2载体中。重组质粒转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105后注射本氏烟(Nicotianabenthamiana)。提取烟草中瞬时表达的蛋白,以HA抗体或c-Myc抗体进行免疫共沉淀实验,最后免疫混合物通过c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况。结果表明,RSV NSvc4蛋白与NB8能够发生互作,而NSvc4与NB9蛋白之间未检测到互作现象。最后,本研究利用荧光定量PCR技术,对NB8、NB9基因,在水稻病叶和水稻健叶中mRNA表达量的情况分别做了检测。NB8在水稻病叶中mRNA表达量与水稻健叶含量相比较没有明显变化,NB9 mRNA表达量比在健叶中有下降。