FK506对高糖培养大鼠视网膜Müller细胞生物学特性的影响

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第一部分:视网膜Müller细胞的培养及FK506半数抑制率研究  目的:培养、鉴定视网膜Müller细胞,检测FK506对视网膜Müller细胞的IC50,为FK506对Müller细胞的生物学作用研究提供实验基础。  方法:采用含10%胎牛血清的DMEM培养基(含D-葡萄糖5.5mmol/L),培养大鼠永生化视网膜Müller细胞。Müller细胞培养12、24、48h倒置显微镜下观察Müller细胞形态并照相记录。以谷氨酰胺合成酶(GS)免疫细胞化学染色鉴定。MTT法检测FK506作用于视网膜Müller细胞的生长抑制率。  结果:光镜观察见Müller细胞呈典型的多角形,细胞大小均匀,细胞边界清晰,形态无明显差异。Müller细胞GS抗体免疫细胞化学染色(+),细胞质中和细胞膜上出现棕黄色、棕褐色颗粒状或者网状物质。MTT法检测Müller细胞的生长抑制率,FK506IC50=75pg/ml。  结论:Müller细胞生长良好,FK506的IC50=75pg/ml。  第二部分:FK506对高糖培养视网膜Müller细胞VEGF表达的影响  目的:采用FK506干预大鼠视网膜Müller细胞,观察其对Müller细胞VEGF基因表达的影响,从而探讨FK506对高糖培养的视网膜Müller细胞中VEGF基因表达的调控作用。  方法:采用常规DMEM培养基(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L),配制高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L)。分组:正常对照组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L),FK506组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L+FK50675pg/ml),高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L),高糖+FK506组(D-葡萄糖浓度50mmol/L+FK50675pg/ml)。ELISA检测FK506对常规和高糖培养条件下的大鼠视网膜Müller细胞上清中VEGF的表达。RT-PCR检测Müller细胞中VEGF基因的表达。  结果:ELISA检测各组Müller细胞中VEGF浓度:结果表明高糖组比正常对照组细胞上清中VEGF的表达浓度升高(P<0.05)。在高糖+FK506组较单纯高糖组细胞上清中VEGF的表达浓度降低(P<0.05)。  RT-PCR检测各组的光密度值:高糖组较正常对照组的视网膜Müller细胞VEGF基因mRNA的表达增高(P<0.05);高糖+FK506组较高糖组VEGF基因mRNA的表达降低(P<0.05)。  结论:FK506可抑制高糖培养的视网膜Müller细胞VEGF的表达。  第三部分:FK506对高糖培养视网膜Müller细胞凋亡的影响  目的:观察FK506对高糖培养视网膜Müller细胞凋亡的影响。  方法:采用常规DMEM培养基(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L),配制高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L)。实验分组:正常对照组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L),FK506组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L+FK50675pg/ml),高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L),高糖+FK506组(D-葡萄糖浓度50mmol/L+FK50675pg/ml)。流式细胞仪检测视网膜Müller细胞凋亡比例。免疫细胞化学染色检测FK506对常规及高糖培养条件下的大鼠视网膜Müller细胞中的P53、Bcl-2、Fas及caspase-3表达的影响。  结果:FCM检测各组凋亡比例:提示高糖组较正常对照组的凋亡比例明显上升(P<0.05);高糖+FK506组比高糖组的视网膜Müller细胞的凋亡比例下降(P<0.05)。  免疫细胞化学染色检测各组的OD值:a.高糖组视网膜Müller细胞P53、Fas及caspase-3的表达较正常组升高(P<0.05);FK506+高糖组比高糖组视网膜Müller细胞P53、Fas及caspas的表达明显降低(P<0.05)。b.高糖组视网膜Müller细胞Bcl-2的表达较正常组降低(P<0.05);FK506+高糖组比高糖组视网膜Müller细胞Bcl-2的表达明显升高(P<0.05)。  结论:FK506可抑制高糖培养的大鼠视网膜Müller细胞的凋亡。
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