为了适应复杂的生存环境,植物在长期的进化过程中产生了种类繁多且功能各异的代谢产物,以应对时刻变化的外界因素以及各种胁迫。硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是白花菜目植物所特有的一类含硫、氮的重要次生代谢产物。近年来硫苷的代谢途径被称作研究次生代谢产物的―模式系统‖,硫苷在植株防御、硫元素的调节以及人类预防多种疾病等方面都发挥着重要的作用。多种多样的胁迫促使植物体内产生了多种功能各异的硫苷,而且硫苷还很容易受到其它防御化合物的诱导,这些都导致硫苷的代谢调控网络及其硫苷调控机制的研究十分复杂。与拟南芥拥有共同祖先的重要的油料作物油菜由于其异源四倍体基因组的复杂性,硫苷代谢的研究目前还不够深入,一定程度上影响了硫苷的防御功能在油菜中的应用。为了深入了解硫苷调控及其生物学功能,我们开展了以下三个方面的研究:1)利用共表达分析拟南芥中新进化来的苯甲酰氧基硫苷代谢途径的相关基因,鉴定并验证了两个保守的转录因子MYB115和MYB118可以调控硫苷代谢的相关基因的表达;2)分析了甘蓝型油菜中三个硫苷合成途径上的基因Bn MAM1、Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在硫苷代谢途径中的功能和作用;3)将这三个基因在甘蓝型油菜中过表达后探索转基因植株叶片的抗菌核病和灰霉病的能力。主要研究结果如下:1、通过对拟南芥中新进化的种子特异的苯甲酰氧基硫苷代谢的相关基因(AOP3、BZO1和SCPL17)共表达分析,鉴定到两个可能调控硫苷代谢的保守的转录因子MYB115和MYB118。与硫苷合成代谢相关基因的酵母单杂交验证和基因表达分析表明,这两个转录因子参与拟南芥硫苷的代谢调控。对MYB115和MYB118单基因缺失突变体的种子、叶片和花器官中硫苷含量分析发现,这两个转录因子的突变导致种子中与AOP3和BZO1相关的亚磺酰基类、羟基类和苯甲酰氧基类硫苷均发生了显著地变化;虽然MYB115和MYB118在叶片中仅有极微量的表达,但这些器官中的脂肪族硫苷均有不同程度的改变;在myb115和myb118突变体的所有的花器官中短链的亚磺酰基类硫苷均有显著地提高,而所有种子、叶片和花器官中的吲哚族硫苷的含量和野生型对照相比均无显著的差异。功能互补实验证明,引入野生型基因到突变体后上述目标性状均能恢复到野生型水平,进一步说明了这两个转录因子参与了多个器官的硫苷代谢调控。2、通过检测MYB115和MYB118双突变体的种子中硫苷含量,结合单、双突变体中相关基因的表达分析,发现这两个转录因子对于调控部分脂肪族硫苷是功能冗余的且存在上位互作效应。此外,MYB115和MYB118以不同的互作模式调控了苯甲酰氧基硫苷代谢相关基因AOP3和BZO1的表达:myb118aop3双突变体中相对于各个单突变体,它的4-亚磺酰丁基硫苷含量显著增加但与其相对应的4-甲硫丁基硫苷并没有提高;在myb115aop3双突变体中4-甲硫丁基硫苷的含量却增加了;双突变体myb118bzo1积累了大量的短链羟基类硫苷,同时它的底物甲硫烷基类硫苷和亚磺酰基类硫苷有着不同程度减少,但myb115bzo1和单突变体bzo1的各种硫苷含量仅有微小的差别。上述结果说明了MYB115和MYB118是两个保守的转录因子且调控了拟南芥中新进化的苯甲酰氧基硫苷代谢,我们因此推断出新进化的代谢途径也可以被保守的调控因子所调控,并不一定需要重新进化新的调控因子,这一结论进一步完善了新进化基因的调控模型。3、我们分别克隆了甘蓝型油菜中脂肪族硫苷合成途径上的两个基因Bn MAM1和Bn CYP83A1,以及参与了脂肪族硫苷和吲哚族硫苷合成途径上的一个基因Bn UGT74B1。通过油菜接种病菌实验发现Bn MAM1和Bn CYP83A1参与了对核盘菌的入侵的早期响应,而Bn UGT74B1在核盘菌侵染的整个时期均有比较高的诱导表达;与菌核病的响应不同的是Bn MAM1和Bn CYP83A1在灰霉菌入侵过程中的表达水平持续降低,而Bn UGT74B1在全过程都有比较高的诱导表达。这些结果说明了甘蓝型油菜在应对这两种死体营养型病菌入侵时脂肪族硫苷和吲哚族硫苷的响应模式可能是不同的。与野生型对照相比,在甘蓝型油菜过表达上述三个基因后,转基因油菜叶片部分脂肪族硫苷含量有所提高(2OH3B GLS和3-Butenyl GLS),过表达Bn UGT74B1还导致叶片吲哚族硫苷(I3M GLS)含量显著提高,这些结果进一步阐述了Bn MAM1,Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在甘蓝型油菜的硫苷代谢途径中的相应的功能。4、分别在三个过表达基因的甘蓝型油菜叶片接种核盘菌和灰霉菌,发现过表达Bn UGT74B1的植株叶片接种核盘菌16 h时和接种灰霉菌32 h的发病率均在12%之内,而野生型对照接种这两种病相同时期的发病率都在90%以上,而且过表达Bn UGT74B1的植株叶片接种核盘菌48h时和接种灰霉菌76 h的病斑面积也都显著地小于野生型对照的病斑面积;而过表达Bn MAM1和Bn CYP83A1的植株叶片和野生型对照在发病时期和控制病斑面积上均无显著的差异。上述结果说明了脂肪族硫苷和吲哚族硫苷在甘蓝型油菜植株叶片防御菌核病和灰霉病上发挥的作用并不相同,可以通过改变硫苷的种类或含量进而提高植株对某些病菌的抗性。这些结果可为创建抗病育种材料以及制定育种策略提供参考信息。