论文部分内容阅读
目的通过建立戊四氮（Pentetrazol,PTZ）慢性点燃癫痫幼鼠模型,观察致痫幼鼠海马组织线粒体分裂动力相关蛋白1（Dynamin-related Protein1,Drp1）、线粒体融合蛋白1（Mitofusion-1,Mfn1）及平衡型核苷转运载体1（Equilibrative Nucleoside Transporter1,ENT1）表达水平的动态变化,探讨调控线粒体裂变对PTZ致痫幼鼠行为学及海马组织线粒体动力学、氧化应激和ENT1的干预影响,并进一步探讨其可能的作用机制。方法1.PTZ慢性点燃癫痫幼鼠模型的建立本实验通过每日腹腔注射戊四氮40mg/kg一次,共给药14天,建立PTZ慢性致痫大鼠幼崽模型。2.线粒体动力学蛋白和ENT1在小儿癫痫中的作用及机制（1）为了观察线粒体分裂蛋白Drp1、融合蛋白Mfn1和ENT1在癫痫中的动态表达,我们将21日龄的Wistar大鼠随机分成5组（n=10）:正常组（CON组）,PTZ组（3h）,PTZ组（6h）,PTZ组（24h）,PTZ组（72h）。（2）为探讨调控线粒体裂变对减轻PTZ致痫幼鼠海马损伤的机制研究,我们应用线粒体裂变抑制剂（Mitochondrial Division Inhibitor,Mdivi-1）和线粒体裂变激动剂（Mitochondrial Division Agonist,WY14643）在建模成功后进行干预处理。21日龄Wistar大鼠分为4组（n=10）:CON组,PTZ组,PTZ+Mdivi-1组,PTZ+WY14643组。检测以下指标:1)每只幼鼠给药后1h的行为学变化;2)应用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测各组幼鼠海马组织Drp1、Mfn1、ENT1基因及蛋白表达水平;3)应用免疫组化检测各组幼鼠海马组织Drp1、Mfn1、ENT1的分布情况;4)应用透射电镜检测调控线粒体裂变后各组幼鼠海马CA1区（Hippocampal CA1 Subfield,CA1区）线粒体超微结构;5)应用总超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）比色法和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）比色法测定调控线粒体裂变后各组幼鼠海马组织中SOD和MDA的含量变化。结果1.幼鼠行为学变化（1）正常组行为无特殊,经戊四氮腹腔注射建模后,癫痫组都有癫痫发作,平均首次发作时间为3.96±1.25天;第一次发作潜伏期是120.50±4.46秒,发作V级次数为2.51±0.63次;成功被点燃的平均时间为8.75±1.41天,点燃率是92.5%,死亡率为7.5%。（2）正常组行为无特殊,PTZ组的最后一次平均发作潜伏期为120±3秒,半小时内平均发作次数为8±1次;与PTZ组对比,PTZ+Mdivi-1组的发作潜伏期明显延长,并且半小时内的发作次数明显减少;与PTZ组对比,PTZ+WY14643组的发作潜伏期明显缩短,并且半小时内发作次数明显增多。2.PTZ致痫幼鼠海马组织Drp1、Mfn1、ENT1的动态变化与正常组对比,RT-q PCR、WB结果显示PTZ组（3h）,PTZ组（6h）,PTZ组（24h）,PTZ组（72h）中Drp1和ENT1表达上调,Mfn1表达下调,并且都在24h有个峰值;免疫组化结果显示在PTZ致痫幼鼠海马组织CA1区中Drp1和ENT1阳性细胞数明显增多,Mfn1减少。3.调控线粒体裂变后PTZ慢性致痫幼鼠海马组织相关变化（1）透射电镜检测海马CA1区线粒体的超微结构显示:在正常组中,线粒体正常,并保持完整的内外膜,清晰的嵴和光滑的基质;与之相比,PTZ组中的线粒体表现出肿胀、扩张、外膜破裂和嵴破坏;与PTZ组对比,PTZ+Mdivi-1组的线粒体则轻度肿胀,有轻度的嵴和内外膜破坏;而PTZ+WY14643的线粒体则出现严重破坏,几乎看不见完整线粒体形态。（2）与正常组对比,PTZ组的SOD活力减弱,而MDA含量增加;与PTZ组对比,PTZ+Mdivi-1组SOD活力增强,MDA值减小;与PTZ组对比,PTZ+WY14643组SOD活力更加减弱,MDA含量增多。（3）与正常组对比,RT-q PCR、WB、免疫组化结果结果都显示PTZ组的Drp1和ENT1表达上调,Mfn1表达下调;与PTZ组对比,PTZ+Mdivi-1组Drp1和ENT1表达下调,Mfn1表达上调;与PTZ组对比,PTZ+WY14643组Drp1和ENT1表达上调,Mfn1表达下调。结论1.幼鼠慢性点燃癫痫发作后海马组织内Drp1 m RNA、蛋白表达增加,Mfn1表达减少,推测幼鼠癫痫病理损伤过程中可能有线粒体分裂和融合参与,即线粒体分裂融合失衡与幼鼠癫痫发作可能有关。2.调控线粒体分裂对幼鼠慢性点燃癫痫发作后海马组织有影响,抑制线粒体裂变,下调Drp1的表达,保护线粒体动力学的稳定,抑制氧化应激,影响ATP生成,减少ENT1的释放,改变兴奋性氨基酸递质的变化,而增加线粒体裂变则出现相反的结果,则提示线粒体裂变-线粒体动力学改变-氧化应激（ROS）-ENT1释放可能是癫痫产生的一条机制通路。