本研究将为阐明肿瘤对顺铂产生耐药性的机理提供新的依据和理论基础，为癌痛患者化疗时合理使用镇痛药提供理论依据。 第一章由Cx26/Cx32组成的缝隙连接对顺铂毒性的影响 目的： 本研究拟在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞上，用多种方法改变GJ功能，通过观察GJ功能改变对顺铂细胞毒性的影响，深入探讨GJ与顺铂细胞毒性的关系。 方法： 在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞，用"标准细胞集落形成分析法"和SRB法测定顺铂对细胞生长的抑制作用。 结果： 1.不同细胞生长密度对顺铂细胞毒性的影响 细胞集落形成实验结果显示：在生长融合和生长未融合的细胞，5μM顺铂作用1小时后，都能够显著地降低细胞集落形成率。在生长融合细胞，顺铂对细胞集落生长的抑制率明显高于生长未融合细胞。 2.改变Connexin表达对顺铂细胞毒性的影响 Western Blotting结果显示，未加doxycycline的细胞无Cx表达。随着doxycycline浓度的增加，Hela细胞内Cx26/Cx32蛋白表达水平逐渐增加。细胞接种荧光示踪实验显示，随着doxycycline浓度的增加，细胞通过GJ的荧光传递功能逐渐增强。 3.抑制GJ功能对顺铂细胞毒性的影响 细胞接种荧光示踪实验显示，与对照组相比，25μM oleamide组和10μM18-α—GA组的细胞荧光传递功能显著降低。 4.增强GJ功能对顺铂细胞毒性的影响 细胞接种荧光示踪实验显示，与对照组相比，10μM RA组的细胞荧光传递功能增强。 结论： 1.GJ形成能够显著增强顺铂的细胞毒性；而Cx在未形成GJ前并不影响顺铂的细胞毒性。 2.降低GJ功能可降低顺铂的细胞毒性。 3.增加GJ功能可增强顺铂的细胞毒性。 第二章不同Cx组成的缝隙连接对顺铂细胞毒性的影响 目的： 本研究拟用已经建立的，转染并稳定表达单一 Cx26或Cx32的Hela细胞，以及天然表达Cx43的TM4细胞，观察由不同Cx组成的GJ对顺铂细胞毒性的影响；并探讨GJ的功能状态与顺铂细胞毒性的关系。 方法： 在转染并稳定表达单一 Cx26，Cx32的HeLa细胞及天然表达Cx43的睾丸支持细胞，用“标准细胞集落形成分析法”测定顺铂对细胞生长的抑制作用。用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞与生长未融合细胞。在上述不同密度接种的细胞，观察由单一 Cx26，Cx32及Cx43组成的GJ对顺铂的细胞毒性影响。 结果： 1.转染Cx26，Cx32的Hela细胞集落形成实验结果显示：在生长融合和生长未融合的细胞，顺铂对细胞集落形成的抑制作用与细胞生长的融合程度有关。在生长融合细胞，顺铂对集落形成的抑制作用显著高于生长未融合细胞。 2.细胞接种荧光示踪实验显示，与对照组相比，25μMoleamide组和10μM18-α—GA组的细胞荧光传递功能显著降低细胞集落形成实验结果显示：在高密度接种细胞，用25μM oleamide和10μMα—GA抑制GJ功能，5μM顺铂对细胞集落形成的抑制作用显著降低；而在低密度接种细胞，oleamide，18-α—GA对顺铂的集落形成抑制作用无明显影响。 3.细胞接种荧光示踪实验显示，与对照组相比，10μM RA组细胞荧光传递功能显著增强。细胞集落形成实验结果显示：在高密度接种细胞，用10μM RA增强GJ功能后，5μM顺铂对细胞集落形成的抑制作用显著增强。而在低密度接种细胞，RA对顺铂抑制集落形成的作用无明显影响。 4.细胞接种荧光示踪实验显示，在表达Cx43的TM4细胞中，与对照组相比，50 nM TPA组的细胞荧光传递功能显著降低。细胞集落形成实验结果显示：在高密度接种细胞，用50 nM TPA抑制GJ功能，10μM顺铂对细胞集落形成的抑制率明显增强。 5.Western Blotting结果显示：siRNA处理后，TM4细胞中Cx43蛋白表达明显降低。细胞接种荧光示踪实验显示：siRNA可明显抑制由Cx43组成的GJ功能。 结论： 1.Hela细胞中，由单一 Cx26、Cx32组成的GJ形成能够增强顺铂的细胞毒性；TM4细胞中，由Cx43组成的GJ形成能够降低顺铂的细胞毒性。 2.抑制由Cx26或Cx32组成的GJ功能可降低顺铂的细胞毒性；增强由Cx26或Cx32组成的GJ功能可增加顺铂的细胞毒性。 3.抑制由Cx43组成的GJ功能增强顺铂的细胞毒性。 第三章Cx26/Cx32组成的细胞缝隙连接对顺铂诱导细胞凋亡的影响 目的： 在转染并稳定表达Cx26/Cx32的Hela细胞，观察GJ功能变化对顺铂诱寻细胞凋亡的影响，并探讨其机理。 方法： 在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞，采用“Annexin V/PI双染结合流式细胞术”及“Hoechst33258荧光染色法”检测细胞凋亡。 在生长融合的细胞，加doxycycline诱导Cx表达，获得有GJ形成的细胞；观察GJ形成对顺铂诱导细胞凋亡的影响。在GJ形成的细胞中，用药物改变GJ功能，观察GJ功能变化对顺铂诱导细胞凋亡的影响。 在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞，采用“比色法”检测细胞凋亡通路中Caspase3，8，9活性。 结果： 1.“Annexin V/PI双染结合流式细胞术”及“Hoechst33258荧光染色法”结果均表明，20μM顺铂作用Hela细胞24小时，细胞凋亡率明显增加。有GJ形成的细胞，顺铂引起的细胞凋亡率明显高于无GJ形成的细胞。 2.“Annexin V/PI双染结合流式细胞术”及“Hoechst33258荧光染色法”结果均表明，在GJ形成的Hela细胞，20μM顺铂作用Hela细胞24小时，细胞凋亡率明显增加。与单用顺铂组相比，GJ抑制剂oleamide与顺铂合用组的细胞凋亡率显著降低。GJ增强剂RA与顺铂合用组的细胞凋亡率显著高于顺铂单用组。 3.“比色法”测定结果表明，20μM顺铂作用Hela细胞24小时，细胞内Caspase3，8，9活性明显增加。在有GJ形成的Hela细胞，顺铂引起的胞内Caspase3和Caspase9活性升高程度显著高于无GJ形成的细胞。用oleamide抑制GJ功能，显著降低顺铂升高细胞内Caspase3和Caspase9活性的作用。GJ增强剂RA与顺铂合用，可增强顺铂升高细胞内Caspase3和Caspase9活性的作用。 结论： 1.由Cx26/Cx32组成的GJ能够增强顺铂诱导细胞凋亡的作用。 2.降低GJ功能可减弱顺铂诱导细胞凋亡的作用；升高GJ功能可增强顺铂诱导细胞凋亡的作用。 3.GJ可以通过线粒体途径增高细胞内Caspase3活性，增强顺铂诱导细胞凋亡的作用。 第四章镇痛药对细胞缝隙连接的作用及其对顺铂细胞毒性的影响 目的： 在转染并稳定表达Cx32的Hela细胞，观察三种不同化学结构的镇痛药对GJ功能和顺铂细胞毒性的影响；并探讨镇痛药改变GJ功能的作用与其对顺铂细胞毒性影响的关系。 方法： 在转染并稳定表达Cx32的HeLa细胞中，用“标准细胞集落形成分析法”测定顺铂对细胞生长的抑制作用。用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞与生长未融合细胞。在上述有GJ形成和无GJ形成的细胞，观察三种镇痛药对顺铂细胞毒性的影响。 采用“细胞接种荧光示踪法”检测三种镇痛药对由Cx32组成的GJ功能的影响。 Western Blotting法检测三种镇痛药对细胞内Cx32蛋白表达水平的影响。 结果： 1.三种镇痛药对顺铂细胞毒性的影响 细胞集落形成实验结果显示：在生长融合和生长未融合的细胞，5μM顺铂作用1小时后，都能够显著地降低细胞集落形成率。在生长融合的细胞，10μg/ml曲马多和氟比洛芬酯与顺铂联用，可显著降低顺铂的细胞毒性。而在生长未融合的细胞，10μg/ml曲马多和氟比洛芬酯对顺铂的细胞毒性无明显影响。 2.三种镇痛药对转染Cx32的Hela细胞GJ功能的影响 细胞接种荧光示踪实验显示，与对照组相比，曲马多和氟比洛芬酯组的细胞荧光传递功能显著降低，结果表明曲马多和氟比洛芬能降低由Cx32组成的GJ功能。而同样浓度的吗啡对细胞荧光传递无影响。 3.镇痛药对细胞内Cx32蛋白表达的影响 Western Blotting结果显示，未用doxycycline诱导的Hela细胞不表达Cx32。与对照组相比，10μg/ml的曲马多作用1小时，可增加Cx32表达水平。但作用时间延长至4h和48h，曲马多对Cx32蛋白表达并无影响。氟比洛芬酯作用1h，4h和48h对Cx32蛋白表达均无影响。 结论： 1.曲马多和氟比洛芬酯均通过抑制Cx32组成的GJ功能，而减弱顺铂的细胞毒性作用， 2.曲马多和氟比洛芬酯抑制GJ功能与Cx32蛋白表达改变无关。 3.吗啡对由Cx32组成的细胞缝隙连接功能及顺铂细胞毒性均无影响。