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一、研究背景蜱(Ticks)是一种专性吸血节肢动物,分布于世界各地,几乎可以寄生于包括人类在内的所有陆栖脊椎动物。由斑点热群立克次体(Spotted fever group rickettsia,SFGR)引起的斑点热(Spotted fever)是一种蜱传立克次体病(Tick-borne Rickettsioses),是在世界范围内严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病。在我国,已经确定存在125种蜱,包括111种硬蜱和14种软蜱,丰富的蜱种导致蜱媒病原体的多样性。目前在我国大陆已发现21种SFGR,近些年新的SFGR不断出现,给我国畜牧业的发展和人民的健康带来严重危害,其中在我国报道有人感染病例的SFGR有8种。除此之外,尚有一些导致人类疾病的立克次体未被定种,媒介蜱或动物宿主中一些致病性未知以及已被明确导致人类疾病的SFGR也不断被发现。但研究区域主要局限在我国北方地区。随着我国蜱传立克次体研究范围逐步扩大,我国南方部分省区已有媒介蜱和宿主动物检测出SFGR的DNA,宿主动物和人群中主要为血清学和分子流行病学调查,蜱传新立克次体的发现和分离鉴定报道较少。我国南方的生境不同于北方,地区优势蜱种不同,媒介蜱携带的病原体也不尽相同,新的蜱传立克次体不断发现提示我们,要扩大调查研究的范围,加强病原体的分离鉴定及其致病性研究。二、研究目的(1)发现我国南方地区新SFGR;(2)获得新发SFGR分离株,并掌握其特征。(3)确定新发SFGR的潜在致病性。三、实验方法在位于我国南方地区的广东、广西、云南省选择调查地点,在蜱活跃期即春夏和初秋时节采集活蜱标本,利用分子生物学技术进行筛查,发现新SFGR种类。通过宿主细胞分离培养立克次体;吉姆萨染色实验、超薄切片透射电镜观察立克次体形态学。运用巢式PCR的方法对SFGR特异性基因(glt A、omp A、omp B、17k Da、sca1和sca4)进行PCR扩增,鉴定新发SFGR基因型。使用第三代测序仪Pac Bio进行全基因组测序。通过空斑实验,比较不同立克次体空斑形成过程和空斑形态的差异。利用立克次体动物免疫实验使宿主动物产生特异性抗体。开展哨点医院监测及自然疫源地调查,检测新立克次体在宿主动物和人类中的感染情况。四、研究结果在广东、广西和云南共采集媒介蜱标本共938只,包含7个蜱种。筛查蜱标本立克次体阳性率为12.86%(75/583),共发现两种新型SFGR以及一种SFGR新记录。在台岛血蜱中发现的Candidatus Rickettsia sp.GD01与Rickettsia tamurae strain AT-1进化关系较近,为SFGR新型别;在豪猪血蜱、斯坦因革蜱、血红扇头蜱、微小扇头蜱、猛突血蜱和卵形硬蜱六种蜱中均检出立克次体Candidatus Rickettsia longicornii strain GD02,与Candidatus Rickettsia longicornii isolate ROK-HL727具有高度同源性,为SFGR新记录;在猛突血蜱中发现的云南立克次体(Rickettsia yunnanensis sp.nov)与Rickettsia hoogstraalii isolate Av202进化关系较近,为新种SFGR,根据其来源,暂命名为云南立克次体“Rickettsia yunnanensis sp.nov.”。研究成功获得R.yunnanensis实验室分离株和全基因组序列。形态学鉴定发现:R.yunnanensis长0.8~1.5μm,宽0.3~0.4μm,为微小短杆或长杆状小体,镜下可见细胞壁完整清晰,具有立克次体典型双层膜结构。立克次体空斑实验研究发现:R.yunnanensis的空斑形成速度与细胞损伤程度与致病性立克次体R.heilongjiangensis和R.conorii相近,较R.raoultii强。通过动物免疫实验发现:R.yunnanensis可以成功感染小鼠,而且实验小鼠获得了R.yunnanensis抗血清。在263份发热患者样本和175份宿主动物样本中未发现R.yunnanensis感染人类和宿主动物情况。但在发热患者样本中,发现存在其他立克次体感染17例(6.46%)。其中16例西伯利亚立克次体R.sibirica(6.08%),1例拉乌尔立克次体R.raoultii(0.38%)。五、研究结论研究首次发现两种新SFGR和一种SFGR南方地区新纪录,并从蜱中分离到一个SFGR新种,获得其形态学证据和全基因组序列,发现其具有潜在致病性。我国南方地区蜱种丰富,蜱媒病原体种类多样性较高,需进一步拓展自然疫源地调查,开展新发蜱媒病的分布与流行规律研究。六、意义与创新性在媒介蜱和宿主动物种类繁多的我国南方采集样本,扩大我国蜱传SFGR调查范围,发现了多种新型SFGR。获得了分离株和系统的病原学特征,从血清学、病原学及分子流行病学等方面确立了我国南方蜱传新SFGR可能的自然疫源地,为研究SFGR的致病机制提供基础,从而有的放矢的制定防控策略。从媒介调查入手了解携带病原体的本底,再评价其致病性,是前瞻性开展传染病主动防控的有益探索和实践。