根据《新兽药研制管理办法》及中兽药、天然药物分类及注册资料要求中第三类药物的研制规定,本研究采用超微粉碎技术将复方中草药HD-1原料制为粉剂。通过对HD-1粉剂开展原料定性鉴别、制剂工艺、质量标准及其对盾纤毛虫(蟹栖异阿脑虫Mesanophrys carcini)的抑制效果分析、大菱鲆血清相关免疫酶的影响、组织病理研究、靶动物的安全性试验,为HD-1粉剂申报新渔药奠定基础。主要研究结果如下:1.HD-1君药的定性鉴别及制作工艺以现行2015年版《中国兽药典》及《中药材显微鉴别彩色图谱》为标准,对HD-1中的君药—青蒿、槟榔、川楝子进行性状鉴别及显微鉴别。结果表明:青蒿表面黄绿色或棕黄色,直径2~7mm,叶暗绿色,具有特异气香,味微苦;显微鉴别特征为木薄壁细胞呈淡绿色,类正方形,叶色素块细胞呈棕黄色,类长方形,大小不一,表皮细胞呈不规则形状。槟榔扁圆形,直径20~30mm,表面淡红棕色,质坚硬,气微,味涩;显微鉴别特征为外胚乳与内胚乳形成大理石样花纹,内胚乳细胞为白色,多角形。川楝子类球形,表面金黄色至棕黄色,直径17~30mm,外果皮为革质,果肉呈淡黄色,果核卵圆形,质坚硬,气特异,味酸、苦;显微鉴别特征为果皮石细胞呈不规则的长多角形,种皮细胞呈橙黄色,近方形,种皮色素层细胞腔内充满红棕色物。采用超微粉碎技术对三个批次的HD-1原料粉碎效果研究表明:HD-1原料经过200目的超微粉碎后产品收率较高,三个批次的产品收率为98.2%、98.0%、97.6%;外观为粉末状,黄褐色或青褐色,气味清香,味甘苦、微涩,平均水分含量为2.44%、2.58%、2.00%,均符合《中国兽药典》规定。显微鉴别结果显示,超微粉碎后药材的细胞破壁率高,粉碎粒度均匀。2.HD-1产品的质量标准研究参考《中国兽药典》对上述三个批次原料制作的HD-1产品进行质量标准研究。结果显示:三批次原料制作的HD-1均为粉末状、灰黄色,气味清香,味甘苦;水分含量分别为2.48%、2.55%、2.12%,均未超过规定的5%;粒度百分比分别为99.54%、98.23%、98.37%,药物粉碎均匀,大于规定的95%;产品的溶解度较好,有部分沉淀产生;产品休止角分别为26.6°、29.2°、28.4°,与普通粉的休止角相比显著减小;平均装量差异分别为0.70%、0.68%、0.67%,均未超过规定的±5%;细菌含量和酵母菌含量分别≤10~3CFU/g、≤10~2CFU/g,均达到微生物限度检查的标准,霉菌较少,大肠埃希菌未检出;薄层色谱法检查中,三批样品色谱斑点清晰,重现性好,阴性对照无干扰。各项指标检查结果均符合药典中规定。3.HD-1对大菱鲆盾纤毛虫病的治疗药效研究利用复方中草药HD-1拌饵投喂的方法对大菱鲆盾纤毛虫病进行治疗效果研究,拌饵剂量分别为0(对照)、10g/kg、15g/kg、20g/kg,治疗时间为35d。结果表明:(1)不同组别0(对照)、10g/kg、15g/kg、20g/kg的累计死亡率分别为46.47%、45.29%、38.12%和25.41%,说明复方中草药HD-1能够降低患盾纤毛虫病大菱鲆的死亡率,其中20g/kg组累计死亡率显著低于其他各组。(2)复方中草药HD-1对病灶处虫体的抑制效果分析,第35d时,对照组和10g/kg组虫体活力强,内质清晰可见;15g/kg组虫体活力变弱,开始萎缩,呈球形,内储颗粒聚集;20g/kg组虫体变小,内质透明,核着色消失,两端组织松弛,呈开放状。(3)拌饵投喂复方中草药HD-1后大菱鲆血清免疫指标结果表明,治疗期间血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)活性、免疫球蛋白M(IgM)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、血清补体C3/C4、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)出现升高的趋势,分别在21d或28d时达到最高值后趋于稳定,15g/kg和20g/kg组显著高于10g/kg组。综上说明20g/kg拌饵治疗剂量对大菱鲆盾纤毛虫病治疗效果较好。4.HD-1对大菱鲆盾纤毛虫病的病理研究对比分析治疗过程中对照组和20g/kg剂量组大菱鲆鳃、皮下肌肉、脑等病灶处组织病理和超微病理,结果可显示:第0~14d时20g/kg组与对照组的每个病灶处的病理相似,有大量虫体寄生在组织中;21d时20g/kg组病灶处的组织开始逐渐开始恢复,肌束溶解情况减轻,脑实质损伤程度降低,鳃小片、肝脏、肾脏等组织结构逐渐恢复,组织中的虫体数量降低,开始萎缩;28d时各组织基本恢复正常,肌纤维束和心肌纤维排列较整齐,鳃丝和鳃小片排列整齐,小脑颗粒层细胞形态清晰,肝细胞结构趋于正常,肠道内环肌结构完整,脾脏红髓和白髓界限清晰,炎症消失,肾小球、肾小管等排列整齐,质地较均匀,组织中有少量虫体,虫体萎缩成球形,内储颗粒聚集。35d时各组织恢复正常,组织中偶见虫体,虫体内质逐渐透明,核着色消失。通过跟踪20g/kg组到45d时,各组织器官与健康大菱鲆组织相同。5.HD-1对大菱鲆的安全性评价为了评价复方中草药HD-1临床用药的安全性,本文对靶动物大菱鲆拌饵投喂推荐治疗剂量的0倍、1倍(20g/kg)、3倍(60g/kg)、5倍(100g/kg)、10倍(200g/kg)的HD-1,通过大菱鲆的成活率、生长性能、脏器系数、组织学等指标评价其临床应用的安全性。结果表明:各组大菱鲆健康、活力强,成活率均为100%;投喂剂量为1倍组的增重率显著高于对照组,3倍组增重率与对照组差异不显著,高于5倍时增重率显著低于对照组;脏器系数和组织学观察,各组别与对照组差异不显著。因此,以推荐治疗剂量10倍拌饵给药对靶动物大菱鲆是安全的,且1倍剂量组对大菱鲆的生长具有促进作用。