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研究背景：流感病毒感染引起的流行性感冒是一种具有高度传染性的呼吸道疾病。流感的传播迅速、死亡率较高,近年来经常发生全球范围的流感大流行,严重危害人类健康。流感病毒引起的肺部病理损伤以肺水肿和广泛炎性渗出为特点。研究发现,肺部病变总是伴有大量的中性粒细胞、单核巨噬细胞等炎性细胞及促炎因子、趋化因子等炎性物质的产生,提示过度的宿主免疫反应是介导病理损伤的主要原因之一。因此,以往作为辅助措施的抗炎治疗逐渐成为流感治疗中的重要环节。中医药具有多成分、多环节的作用特点,不仅具有直接抗病毒作用,还能调节病毒引起免疫病理损伤的复杂过程,在流感的治疗中具有独特的优势。汉黄芩素是黄芩的主要单体成分之一,治疗流感的中药复方中经常使用黄芩。既往临床经验及大量实验研究证明黄芩在流感治疗中具有良好效果。我们的前期研究对黄芩的主要单体成分黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的体外抗流感病毒的作用进行了比较,结果表明,各单体成分在体外抗甲型流感病毒的效果为黄芩苷>黄芩素>汉黄芩素,提示汉黄芩素体外没有直接抗病毒作用。目前对于汉黄芩素在流感治疗中作用的研究甚少,研究已发现,汉黄芩素具有抗自由基、抗炎、免疫调节等作用。我们以此为出发点,研究汉黄芩素在缓解流感病毒导致过度免疫病理损伤中的作用及其机制,从而揭示汉黄芩素在流感治疗中的作用,为其在流感病毒性肺炎治疗中的应用提供科学基础,为阐明黄芩的药理作用提供实验依据。目的：以大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)为模型,观察汉黄芩素对流感病毒感染肺泡巨噬细胞炎症因子产生的影响,以及TLR7介导的MyD88依赖性信号通路中关键信号分子的影响,从而明确汉黄芩素在流感病毒性肺炎治疗中发挥的作用。方法：流感病毒FM1感染大鼠肺泡巨噬细胞NR8383 1 h后去除病毒,用汉黄芩素作用NR8383细胞不同时间后观察：1汉黄芩素对流感病毒感染肺泡巨噬细胞自由基的影响：汉黄芩素(0.016 g/L,0.008 g/L,0.004 g/L)作用后8 h、24 h、36 h、48 h,griess试剂检测细胞上清中一氧化氮(N0)水平。汉黄芩素最大无毒浓度(0.016 g/L)作用后8 h、24 h、36h、48 h,生化法检测细胞内诱导性一氧化氮合酶(iNOS)活性；用药后4 h、8 h、18h、24 h,生化法检测细胞上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。2汉黄芩素对流感病毒感染肺泡巨噬细胞炎性介质的影响：汉黄芩素最大无毒浓度(0.016 g/L)作用后6 h、12 h、24 h,放射免疫法检测细胞上清中炎性介质前列腺素(PGE2)、磷脂酶A2(PLA2)、白三烯(LTB4)的含量。3汉黄芩素对流感病毒感染肺泡巨噬细胞炎性细胞因子的影响：汉黄芩素最大无毒浓度(0.016 g/L)作用后6 h、12 h、24 h,ELISAi去检测细胞上清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、单核细胞趋化因子(MCP-1)的含量；用药后24 h,荧光定量PCR (Rea ltime PCR)检测细胞内TNF-α、MCP-1的mRNA水平。4汉黄芩素对流感病毒感染肺泡巨噬细胞TLR7信号通路中相关信号分子转录的影响：汉黄芩素最大无毒浓度(0.016 g/L)作用后24 h,RT-PCR)去检测细胞内MyD88、NF-κB及TLR7 mRNA水平。5汉黄芩素对流感病毒感染肺泡巨噬细胞内NF-κB核转位及表达的影响：病毒吸附后,2 h、4 h、6 h、8 h、24h时,免疫组化法检测细胞内NF-K B核转位变化；汉黄芩素最大无毒浓度(0.016 g/L)作用后4 h、6 h、24 h,免疫组化法检测细胞内NF-K B核转位变化并进行半定量分析；用药后24 h, Western-blot检测NF-κB蛋白表达。结果：1流感病毒感染后,NR8383的N0、iNOS及MDA产生水平明显升高,总SOD活力下降。与病毒感染组比,汉黄芩素作用后24 h、36 h、48 h,NO水平降低(P<0.01)iNOS活力明显降低(P<0.05)；药物作用后4 h、8 h,明显增强了细胞上清中总SOD活力(P<0.05),降低MDA含量(P<0.05)2流感病毒感染后,NR8383的PLA2、PGE2、LTB4产生量明显升高。与病毒感染组比,汉黄芩素作用后6 h,明显降低了PLA2活力(P<0.01)；用药后,PGE2水平较病毒组低,但无显著性差异(P>0.05)；药物作用后12 h、24 h,LTB4水平较病毒感染组明显降低(P<0.01,P<0.05)3流感病毒感染后,NR8383 TNF-α、MCP-1的mRNA转录及分泌明显增强。与病毒感染组比,汉黄芩素作用后24 h,MCP-1 mRNA水平明显降低(P<0.01),并在作用后6h、12 h、24 h,MCP-1的分泌明显减少(P<0.01)；用药后24 h,TNF-αmRNA水平明显降低(P<0.01),且在12 h、24 h时,上清中TNF-α含量明显降低(P<0.01)4流感病毒感染NR8383后,MyD88、NF-κB及TLR7 mRNA水平明显增加。汉黄芩素作用后24 h,MyD88、NF-κB及TLR7mRNA水平明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。5流感病毒感染NR8383后,2 h时,NF-κB无明显的核转位,与正常组相比,胞浆内表达增强；4 h、6 h时,NF-κB有明显核转位,核内表达增多,胞浆中表达比正常组高；8 h时,NF-κB核内表达减弱,24 h时,NF-κB核内无明显表达,胞浆中NF-κB的表达比正常组明显增高；24 h时,Western-blot与免疫组化结果一致,胞浆内NF-κB表达较正常组明显升高而胞核中未检测出NF-κB。汉黄芩素作用后4 h、6 h,NF-κB胞浆及核内均减少；用药后24 h,NF-κB蛋白胞浆内表达降低。结论：汉黄芩素通过抑制NR8383细胞内iNOS活力,明显降低NO含量,在病毒感染早期(4h、6 h)增加细胞总SOD活性,减少MDA的产生,表明汉黄芩素能减轻N0等自由基对细胞的损伤。汉黄芩素通过抑制PLA2,降低LTB4、PGE2,从而减轻炎性介质诱导的一系列炎症反应。通过抑制TNF-α、MCP-1的转录和表达,降低其他细胞因子及炎性细胞的活化,从而减轻病毒性肺炎的炎性损伤。汉黄芩素抑制流感病毒活化巨噬细胞的通路-TLR7介导的MyD88依赖性信号通路(MyD88-dependent pathway)-中关键信号分子的转录,并抑制NF-κB核转位及表达,从而减少参与炎症反应蛋白的靶基因转录,抑制炎症相关物质的产生,在病毒性肺炎的治疗中起到减轻过度免疫病理反应的作用。