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细胞迁移是指细胞在迁移信号的刺激下产生的定向移动。在迁移过程中细胞的形态由对称形态转变为不对称,出现前缘和尾端,为保持细胞极性和迁移运动效率提供了前提条件。细胞迁移过程分为细胞前端突出、伪足与基质底物的黏着、细胞体迁移和牵引尾部向前这4个步骤。在众多细胞迁移形式中,趋化性迁移和趋电性迁移是两种在生命过程中较为重要的两种迁移方式。其中趋化性迁移是指细胞在化学物质的诱导下沿化学浓度梯度的一种指向性迁移;细胞趋电性迁移是指在直流电场中细胞受到电场的诱导而做出的指向性迁移。大量研究表明,细胞趋化性迁移和趋电性迁移广泛地存在于并影响组织再生、损伤修复、炎症反应、肿瘤转移以及胚胎发育等生物学过程。本实验以盘基网柄菌(Dictyostelum discoideum)作为研究对象,使用限制酶介导突变(Restriction enzyme-mediated integration mutagenesis REMI)的方法构建盘基网柄菌细胞突变库。将野生型盘基网柄菌与突变株作比较,并且将盘基网柄菌突变株进行发育实验以及置于外源性电场中,筛选REMI突变库中的发育缺陷突变株和趋电性突变株。通过发育实验和趋电性实验的筛选,为揭示盘基网柄菌发育、细胞趋化性迁移以及细胞趋电性迁移的机制研究进行新的探索,推动此领域的研究进展。实验内容和结果如下:①盘基网柄菌REMI突变库的构建通过使用限制酶介导突变(Restriction enzyme-mediated integration mutagenesis REMI)的方法构建盘基网柄菌突变库。首先抽提出含有杀稻瘟菌素(BlasticidinS)抗性基因的pBRS-1环状质粒,然后使用限制性内切酶BamHI将pBRS-1环状质粒进行酶切成具有GATC粘性末端的线性DNA片段。此后将具有抗性基因的线性质粒DNA与限制性内切酶DpnII以及经过无菌培养的野生型盘基网柄菌AX2细胞混合进行电穿孔。电压0.85kV,电容0.25μF,脉冲时间0.9ms,间隔5s,共进行电击2次,使限制性内切酶DpnII在盘基网柄菌基因组上随机切出粘性末端(GATC),具有相同粘性末端的线性质粒DNA整合到细胞的基因组中。使用BlasticidinS对电传孔后的细胞进行加药筛选,将加药筛选后存活的盘基网柄菌细胞与克雷伯氏产气杆菌(Klebsiella aerogenes KA)混合,进行有菌培养,产生含有单细胞克隆的噬菌斑。将噬菌斑挑出,进行第2次加药筛选以剔除假阳性。含有BlasticidinS的培养液中成功插入线性DNA的细胞具有抗性,未成功插入的细胞死亡。2次加药筛选后存活的盘基网柄菌细胞判定为突变株,进行扩大培养并冻存构成REMI突变库,共有95个突变株(编号为M1-M95)。②盘基网柄菌发育缺陷突变株的筛选在已构建盘基网柄菌REMI突变库的基础上,将野生型盘基网柄菌AX2分别与突变株M1-M95共同进行发育实验,对突变库中的突变子进行发育缺陷的筛选。经过发育实验筛选,突变库中的71个突变株的发育过程与野生型盘基网柄菌AX2细胞相比,在发育过程中的不同阶段所持续的时间存在异常。在整个发育过程“细胞—聚集—细胞堆—蛞蝓体—孢子”这5个发育阶段中有52个突变株在2个发育阶段出现异常,有9个突变株在3个发育阶段出现异常,有10个突变株在4个发育阶段出现异常。此外有9个突变株在细胞阶段(cell),20个突变株在聚集阶段(aggregation)出现异常,68个突变株在细胞堆阶段(mound)出现异常,71个突变株在蛞蝓体阶段(slug)出现异常。在发育过程中出现异常的突变株中,突变株M26在细胞堆阶段(mound)后在蛞蝓体阶段(slug)出现发育阻滞,与同组的野生型相比在24小时的发育时间内没有出现孢子(spore),且经过延长发育时间至30小时,其也并未进入孢子阶段(spore)。经过分析,我们认为M26是发育缺陷的突变株。③盘基网柄菌趋电性突变株的筛选将野生型盘基网柄菌AX2分别与突变株M1-M95进行趋电性筛选。经过2.5h饥饿处理后将细胞置于同一趋电小室,施加12V/cm的外源性电场加电30min,进行趋电性实验进行趋电性突变株的筛选。对得到的“趋电性指数(Directedness)”、“位移速度(Displacement speed)”、“路程速度(Track speed)”和“位移/路程(Persistency)”这4个趋电性参数进行统计学分析。经过分析,突变株M1-M95的趋电性参数与野生型相比并未显示显著性差异,未筛选到趋电性突变株。