背景及目的:目前,乳腺癌是威胁着全世界女性生命健康的最常见的恶性肿瘤之一,它发展迅速,容易产生转移,且发生因素非常复杂,与环境、遗传、生活方式等都有着紧密的相关性,严重影响了女性的生活质量。据统计,每年在全部因恶性肿瘤死亡的女性中有约13%左右的女性是因乳腺癌而死亡。再者,世界范围内乳腺癌发生率呈逐年递增趋势,患病人群也趋于年轻化[1]。临床医学等各领域对其机制、治疗方法及药物研究不曾间断。目前对乳腺癌的治疗主要包括化学药物治疗、放射治疗、内分泌治疗及手术切除。但是对于乳腺癌晚期的病人,已经丧失了手术机会,而内分泌治疗对三阴性乳腺癌患者无效,同时放射治疗不能选择性的杀灭肿瘤细胞,它在杀死肿瘤组织的同时破坏肿瘤周围的正常细胞及组织,严重者甚至会造成患者骨髓抑制等[2]。故一般多采用化疗药物治疗。但是化疗药物对肿瘤的敏感度低,再者药物的耐药性及对身体的损害一直是摆在临床医生及病人面前的巨大的障碍。基于以上因素,急需要新的安全有效的治疗方法来提高晚期乳腺癌患者的生存期及生活质量。低频超声是一种机械波,因为其特点为频率较低,波长长、强度不高、故容易穿透组织被组织吸收的少,故而对正常组织损伤小。低频超声与组织的主要生物学效应有机械效应、空化效应、热效应及化学效应等,其中空化效应对肿瘤的治疗是现阶段的一个研究热点。空化效应即存在于液体中的微小气泡在超声波的作用下发生振动,当超声波能量达到一个阈值时,微小气泡快速发生膨胀、收缩、崩溃闭合等一系列变化的动力学过程,且同时释放巨大能量[3]。国内外研究显示利用低频超声的空化效应可以破坏肿瘤血管,而血管是肿瘤生长及转移的必要条件。另外低频超声可以增加细胞膜的通透性提高细胞药物浓度,提高药物利用率,降低毒副作用从而抑制肿瘤的生长。随着对低频超声的不断探索研究,低频超声作为一种新型肿瘤治疗的手段,越来越被国内外认可,但是大都尚处于实验室阶段[4]。之前国内外研究多局限于低频超声对肿瘤细胞干预治疗,如前列腺癌细胞、大脑胶质瘤细胞、肝癌细胞等,但是对实体肿瘤的研究较少[5-7]。众所周知,血管在乳腺癌的生长及侵袭等方面扮演着着非常重要的角色。同时紫杉醇类化疗药多西他赛是乳腺癌晚期治疗的主要化疗药物,可以提高患者的生存期,但是仍不能避免的产生耐药而影响治疗效果。故本研究通过对建立的Balb/c小鼠4T1乳腺癌移植瘤模型进行低频超声及多西他赛等不同的干预措施,评价小鼠乳腺移植瘤的体积变化、分析肿瘤微血管密度(MVD)及与侵袭性、血管生成相关的蛋白(VEGF、MMP-9、Notch1)表达情况及MVD与蛋白之间的关联性,从而探讨低频超声对小鼠移植瘤的疗效及相关治疗机制,及低频超声是否能增强紫杉醇类化疗药多西他赛对Balb/c小鼠4T1乳腺移植瘤的治疗效果。方法:1、小鼠乳腺癌4T1细胞的培养:置于恒温37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞增殖达到培养瓶底面积的85%-95%时,根据实验需要进行重悬传代或冻存。2、Balb/c小鼠4T1乳腺癌移植瘤模型的建立:注射4T1细胞悬液至Balb/c小鼠左侧第二对乳腺脂肪垫下(0.3ml/只)。6-8天后成瘤。3、分组:将成瘤小鼠随机分为对照组、多西他赛组、低频超声组、联合组(低频超声治疗+多西他赛);后两组小鼠进行低频超声治疗前30min腹腔注射5%的水合氯醛(0.004ml/g)麻醉。4、记录小鼠的质量变化及计算各组小鼠移植瘤体积及各组小鼠移植瘤的抑瘤率(Tumor inhibition rate,TIR)。5、标本处理:成瘤小鼠治疗5次后,采用颈椎脱位法将其处死,完整解剖出乳腺肿瘤组织。采用Western blot检测各组小鼠移植瘤组织中的VEGF、MMP-9、Notch1等蛋白表达量,采用免疫荧光法检测CD34蛋白标记的肿瘤血管计算肿瘤微血管密度(MVD)。结果:1小鼠质量变化及各组小鼠移植瘤体积及抑瘤率对照组、多西他赛组、低频超声组、联合组四组小鼠均日益消瘦,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组、多西他赛组、低频超声组、联合组肿瘤体积(mm3)分别为:2192±341、1603±336、1211±289、975±106,总体差异存在统计学意义(P<0.05);多西他赛组较对照组、低频组较多西他赛组、联合组较低频超声组体积小,差异均存在统计学意义(P<0.05);对照组、多西他赛组、低频超声组、联合治疗组抑瘤率(%)分别为:0、28.5±12.4、45.6±10.1、55.6±4.3,差异存在统计学意义(P<0.05);低频超声及联合组抑瘤率较多西他赛组高,差异存在显著统计学意义(P<0.05),联合治疗组较低频超声组抑瘤率高,差异存在统计学意义(P<0.05)。2 Western blot结果2.1 MMP-9、VEGF表达情况对照组、多西他赛组、低频超声组、联合组间总体差异存在统计学意义(P<0.05),其中多西他赛组较对照组表达水平低,但此差异不存在统计学意义(P>0.05),低频超声组较多西他赛组、联合组较低频超声组表达水平低,且差异均存在统计学意义(P<0.05)。2.2 Notch-1表达情况对照组、多西他赛组、低频超声组、联合组间总体存在统计学差异(P<0.05);其中多西他赛组较对照组Notch-1表达水平低,差异存在统计学意义(P<0.05),低频超声组较多西他赛组、联合组较低频超声组Notch-1表达水平低,并且差异均存在统计学意义(P<0.05)。3组织免疫荧光法检查CD34标记的肿瘤血管密度(MVD)对照组、多西他赛组、低频超声组、联合组微血管密度差异具有统计学意义(P<0.05);其中多西他赛组较对照组水平低,但差异不具有统计学意义(P>0.05),低频超声较多西他赛组、联合组较低频超声组水平低,并且差异均具有统计学意义(P<0.05)。4 MVD、VEGF、MMP-9、Notch1蛋白表达关系CD34标记的MVD与VEGF、-9、Notch1蛋白表达量呈正相关,相关系数r依次为0.809、0.723、0.856(P<0.05);VEGF与MMP-9、Notch1蛋白表达成正相关,相关系数r分别为0.803、0.810(P<0.05);MMP-9与Notch1蛋白表达量呈正相关,相关系数r=0.715(P<0.05)。结论:1、低频超声能抑制肿瘤体积的生长,显著降低VEGF、MMP-9、Notch1蛋白的表达,抑制肿瘤微血管的形成从而达到降低肿瘤的生长、转移、侵袭性效果。2、多西他赛具有抑制肿瘤生长,降低VEGF、MMP-9、Notch1蛋白的表达,抑制肿瘤微血管的形成的作用,但效果均有限。3、低频超声与多西他赛联合,较单独使用多西他赛、低频超声在抑制VEGF、MMP-9、Notch1蛋白的表达,抑制肿瘤微血管的形成方面效果得到增强。4、CD34标记的MVD、VEGF、MMP-9及Notch1等蛋白表达各组指标两两间均存在正相关的关系,提示低频超声作用于肿瘤组织时可通过Notch信号通路、VEGF通路、MMP-9间的协同作抑制肿瘤的生长,转移。