原发性肝癌(Primary Liver Carcinoma, PLC)是全球常见的消化系统恶性肿瘤之一,其中90%以上为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)。据统计,80%以上的HCC出现在发展中国家,如亚洲的东南部及非洲的中部和西部。我国每年有360,000例HCC新增病例及350,000例HCC死亡病例。广西是我国HCC的高发区,流行病学研究提示黄曲霉毒素饮食暴露和乙肝病毒(HBV)慢性感染是广西地区HCC高发的两大重要的环境致病因素,而且,这两大重要环境致病因素诱发肝癌的相关分子机理也有了较深入的研究。之前的研究均认为,黄曲霉毒素的摄入主要是通过消化道暴露途径；近十余年来,各种针对黄曲霉素饮食摄入的防范措施已经得到了广泛的重视,理论上有望一定程度降低我区HCC的发病率,但据相关的研究和我们的临床观察发现,广西肝癌的发病率并没有明显下降,反而呈现逐年上升的趋势,某些特定区域或人群HCC的发病率仍然较高,如农民,糖厂、造纸厂及家禽养殖场某些工作环境的工人等等。但这些人群的饮食习惯及HBV感染率与其他人群并无明显差异。我们前期的相关调查还发现,上述一些特定人群血清AFB1或人血清AFB1白蛋白加合物(AFB1-ALB)检测呈阳性的发生率较高；国外相关的文献亦有类似报道。这一现象很值得我们高度重视和进一步的研究。我们的一些前期现场调查发现,这些特定人群有一个共同的特点,就是在工作中会经常接触某些粉尘,如蔗渣粉尘、谷物粉尘等。我们知道,广西是一个亚热带地区,温暖潮湿的天气周期较长,极利于霉菌的生长,这类粉尘被霉毒素污染的情况普遍存在；因此,我们怀疑,经呼吸道吸入含霉毒素的粉尘,可能是AFB1进入人体的另一途径,并且可能与这些特定人群HCC的发病有关。为证实这一判断,本研究选取了区内一家大型糖厂作为现场,通过流行病学调查,采取回顾性分析的方法,分析长时间暴露于蔗渣粉尘的人群及其他岗位人群30年肝癌及其他恶性肿瘤的发病情况,对比检测某些特定环境粉尘中AFB1的含量,采集高粉尘工作环境人群及其他岗位人群的静脉血,检测并对比二组人群血清中AFB1-ALB的浓度,初步探讨高粉尘工作环境呼吸道暴露与肝癌及其他恶性肿瘤发病的可能联系；同时通过建立AFB1呼吸道暴露的动物模型,探索AFB1经呼吸道吸入与实验动物AFB1-ALB血清浓度变化的关系,验证AFB1呼吸道暴露对实验动物血清AFB1-ALB浓度的影响。并且通过动物实验,动态检测AFB1呼吸道暴露的实验动物肝脏组织学、细胞学及其P53、P21等基因表达的分子学改变,探讨AFB1呼吸道暴露对实验动物肝脏的影响。本研究的结果有助于更全面地了解AFB1不同暴露途径与肝癌发病的关系,为更有效地预防黄曲霉毒素暴露所导致的肝癌提供新的理论和实验依据。本研究分以下三个部分：第一部分现场流行病学调查及相关岗位人群血清AFB1-ALB检测分析目的：分析蔗渣粉尘暴露与肝癌等恶性肿瘤发病的联系,检测高粉尘作业场所AFB1的污染情况,探索AFB1呼吸道暴露对相关作业人群血清AFB1-ALB浓度的影响。方法：采用回顾性队列研究的方法,选取广西区内一家大型糖厂作为现场,选择该调查现场1984-2013年的员工为研究对象,统计同一现场接触蔗渣粉尘的人群及其他岗位人群30年间肝癌等恶性肿瘤的发病情况。采集高粉尘作业场所及其他作业场所的空气样本,以及高粉尘作业场所的物表蔗渣粉尘样本,使用ELISA法检测所有样本中AFB1的含量。根据纳入标准和排除标准,本研究检测符合纳入标准的相关人员血清AFB1-ALB含量共384人,其中,在高粉尘作业场所(压榨车间、蔗渣仓库、纸厂)的人群为181人(A组),其他岗位的人群203人(B组)。并采用随机抽样的方法,从血清AFB1-ALB检测阳性的职工家庭中采集大米(主食)50例样本,检测这些家庭日常主食的AFB1含量。结果：本研究总计观察119852.9人年,共随访该调查现场1984-2013年的职工5791人。从1984年1月至2013年12月,该调查现场职工(包括退休)共有835人患病,其中患恶性肿瘤的人数为330人,占39.52%。在接触蔗渣粉尘的人群中,恶性肿瘤发病排在疾病谱第一位,其余依次为呼吸系统疾病、心血管疾病等；在其他岗位人群中,位列疾病谱前三位的分别为心血管疾病、恶性肿瘤及呼吸系统疾病。研究分析发现,在接触蔗渣粉尘的人群中,肝癌、肺癌发病的相对危险度显著上升,分别为其他岗位人群的4.30倍及2.63倍,而其他恶性肿瘤发病的相对危险度上升不明显。糖厂不同作业场所的空气样本AFB1检测均呈阴性,但蔗渣粉尘中的AFB1检测呈阳性。ELISA试验检测结果提示,在181例A组工人中,有102名工人AFB1-ALB检测阳性,浓度为38.51±44.80 pg/ml;B组的203名工人仅有12名阳性,浓度为15.58±6.42 pg/ml。两组人群血清AFB1-ALB阳性率及浓度的差异有统计学意义。在血清AFB1-ALB阳性的职工家中采集到的50份大米均未发现AFB1污染。第二部分通过新西兰兔AFB1呼吸道暴露的动物实验验证实验动物血清AFB1-ALB浓度变化与呼吸道暴露的关系目的：探讨AFB1呼吸道暴露对新西兰兔血清AFB1-ALB浓度及肝功能ALT、AST、ALP及TP的影响。方法：选取新西兰兔60只,采取随机分组的方法,分为高暴露组(A组,N=20)、中暴露组(B组,N=20)及低暴露组(C组,N=20)。连续7日通过呼吸道插管滴注AFB1溶液的方法,建立AFB1呼吸道暴露的动物模型。A组、B组及C组新西兰兔每日吸入的AFB1溶液量分别为75ug/Kg、 50ug/Kg及25ug/Kg。检测新西兰兔第1、第3、第7及第21日血清AFB1-ALB的浓度及肝功能ALT、AST、ALP及TP。结果：至实验结束,共有4只新西兰兔死亡,包括A组3只,B组1只。A组的17只新西兰兔中,第1日有8只(47.06%)血清AFB1-ALB检测阳性,浓度为3.35±1.86(1.3-6.8)pg/ml,第3天血清AFB1-ALB阳性的新西兰兔升至10只(58.82%),第7天为11只(64.71%),而到了第21天则降至3只(17.64%)。B组的19只新西兰兔中,第1日有3只(15.79%)血清AFB1-ALB检测阳性,浓度为1.97±0.95(0.9-2.7)pg/ml,第3天血清AFB1-ALB阳性的新西兰兔升至5只(26.32%),第7天为5只(26.32%),而到了第21天则降至2只(10.53%)。C组未发现有血清AFB1-ALB检测阳性的新西兰兔。经呼吸道吸入AFB1后,血清AFB1-ALB阳性的新西兰兔肝功能ALT、AST、ALP及TP的值呈动态性升高,但未发现血清AFB1-ALB阴性新西兰兔肝功能的值出现显著改变。我们分析了AFB1-ALB检测阳性新西兰兔的肝功能,其中,第3天A组新西兰兔的ALT、ALP的值,第7天A、B二组新西兰兔ALT、AST、ALP、TP的值,第21天A组新西兰兔TP的值与对照(吸入AFB1前的兔血清标本)差异有统计学意义。第7日的新西兰兔肝功能ALT及AST的值与血清AFB1-ALB的值存在显著正相关(P<0.05)；但ALP及TP的值与血清AFB1-ALB的值不存在相关(P>0.05)。第三部分 通过建立树鼩AFB1呼吸道暴露的模型,进一步了解实验动物AFB1呼吸道暴露后肝脏组织形态学及P53、P21等基因表达的分子学改变目的：观察AFB1呼吸道暴露对树鼩肝脏P53、P21基因表达的影响及树鼩肝组织形态学的改变,探讨AFB1呼吸道暴露诱发肝癌的可能性。方法：选取健康树鼩80只,采用随机分组的方法,分为A组(空白组,N=40)和B组(呼吸道暴露组,N=40)。A组树鼩只进行标准喂养,不作任何其他干预；B组树鼩除标准喂养外,通过呼吸道插管的方法,给予树鼩雾化吸入AFB1溶液,每日吸入量为200 ug/Kg/D,每周吸入AFB1溶液6次。按设计方案定期采集树鼩血清样本,取树鼩肝组织活检,检测组织形态学改变及P53、P21基因的动态表达情况。结果：本部分实验从2013年9月11号开始,至2015年1月28号结束,共进行了504天(72周)。在实验期间,B组有7只树鼩死亡。至实验结束,A组未发现血清AFB1-ALB阳性的树鼩血清样本,活检提示未发现有肝组织出现异常改变,P53、P21基因动态检测未发现有异常表达。而B组第一周抽血即发现有8只出现血清AFB1-ALB阳性,至第三周,B组全部树鼩出现血清AFB1-ALB阳性。B组树鼩中,从第33周开始,即发现肝组织有轻度炎症反应,以炎细胞浸润汇管区为主,伴肝细胞点状坏死,偶尔见灶状及碎屑样坏死。第43周活检时,可发现肝脏Kuffer细胞增生,炎细胞浸润,还可以见到空泡变性或者透明变性的肝细胞。自72周时,还可见肝组织内结构絮乱,伴嗜酸样变及重度水样变性。B组树鼩P53、P21基因动态检测发现有异常表达。通过以上的系列研究,我们可以得出以下的几点结论：1,经呼吸道吸入是AFB1进入机体的途径；2,血清AFB1白蛋白加合物浓度的升高与其AFB1呼吸道暴露的量及暴露的持续时间有关；3,经呼吸道持续吸入AFB1可造成血清AFB1-ALB阳性的实验动物肝损害;4,AFB1呼吸道暴露是否与HCC的发生有直接联系,值得进一步的研究。