随着原油的广泛开采、使用和运输，原油污染事故频发。原油泄漏到土壤中会通过重力、表面张力和毛细现象向地表和地下扩散，使土壤沥青化和板结化，因此影响其透水性和透气性，进而使土壤失去肥力，同时污染地下水，最终危害动植物生命并对人类产生“致癌，致畸性，致突变”的三致危害。相较于海洋环境中的原油污染，发生在土壤中的原油污染隐弊性大,潜伏期长，涉及面广，治理起来更加困难。祛除原油污染常用的方法有物理法、化学法及生物修复法。但是物理法和化学法有成本高，操作复杂，对设备要求高，会产生二次污染等缺点，而生物修复法是利用微生物自身的代谢来分解污染物，其最终产物是CO2、H2O等物质，不会对环境产生二次污染，被认为是一种绿色的处理方法，而且利用菌株能降解一些用物理、化学方法不易降解的物质。所以说发展生物修复技术将极大的有利于原油污染治理工作。但是相较于常温环境，生物修复技术在冷环境中的应用又更加困难，低温是生物修复技术中的一个重要限速条件。低温不仅会减弱低分子量烷烃的挥发，使大分子量的烷烃粘滞在土壤表面很难被降解，还会使微生物体内细胞液的流动性降低，催化降解污染物的酶活下降，微生物进行生长活动和物质运输的能力减弱，同时低温还会影响核酸二级结构的稳定性从而抑制DNA的复制、mRNA的转录和翻译。若温度低于细胞质冰点，细胞膜通道关闭，细胞质冻结，污染物和营养物质都无法进入细胞，细胞内还会形成冰晶体破坏细胞结构，这样细胞就会停止生命活动。所以说研究低温原油降解菌对生物修复技术在冷环境中的应用是个极大的补充。青藏高原平均海拔4000 m以上，常年处于低气温，长日照的环境中，是地球上重要的冷环境之一。近些年来，由于青藏工程走廊的建设和运营，还有相关旅游业的发展，已经给这个特殊的生态环境带来了不同程度的烃类物质污染，而青藏高原的生态环境极为敏感和脆弱，一旦被破坏后很难恢复，所以加强对此地区原油污染的防治工作十分重要。而已有研究表明青藏高原土壤中有丰富的微生物资源，包括嗜冷微生物和耐冷微生物。所以此次研究以青藏高原土壤为样本，分离具有低温原油降解活性的细菌菌株，研究所筛菌株的原油降解特性，为冷环境原油污染生物修复提供微生物菌种资源。本研究主要内容包括：　　⑴分别在青藏公路沿线班戈桥（BGQ）、沱沱河（TTH）、五道梁（WDL）、北麓河（BLH）、乌丽（WL）、开心岭（KXL）、雁石坪（YSP）、唐古拉山南（TGL）、安多（AD）和当雄（DX）10个样点取样。在10℃条件下筛选并分离到原油降解活性最高的细菌2株，菌株编号为BGQ-6和DX-7。经16S rRNA基因测序比对及GENⅢ鉴定板分析，确定菌株BGQ-6为Rhodococcus qingshengii（KF704114），与最相似模式菌株Rhodococcus qingshengii djl-6T(DQ090961)的相似度为100％，归属于放线菌门；DX-7为Acinetobacter calcoaceticus（KF704064），与最相似模式菌株Acinetobacter calcoaceticusDSM30006T(AIEC01000170)的相似度为99.93%，归属于变形菌门。已经分离到的原油降解菌也多归属于变形菌门和放线菌门。　　⑵在10℃、150rpm条件下对菌株进行摇瓶培养，培养15d后，用GC-MS法测定菌株BGQ-6和DX-7对原油总量及其中含量最高的60种烃类物质的降解率，通过GC-MS检测，这60种烷烃物质分别归属于5类：直链烷烃，支链烷烃，环烷烃，芳香烃和支链烯烃。结果表明：菌株BGQ-6对原油的总降解率为74.14%，对其余5种物质的降解率依次为：直链烷烃77.55%、支链烷烃59.32%、环烷烃44.80%、芳香烃76.06%、支链烯烃93.69%；其中，菌株BGQ-6对短直链烷烃C10的降解率为98.43%，对中链烷烃降解率在80%左右，对碳原子数大于20的长链烷烃的降解率在60%~80%，对 C28和C29的降解率相对较低。菌株BGQ-6对大部碳原子数在12~26之间的支链烷烃的降解率为60%左右。DX-7对原油的总降解率为45.9%，对其余5种物质的降解率依次为：直链烷烃48.95%、支链烷烃46.32%、环烷烃41.67%、芳香烃43.27%、支链烯烃49.75%；其中，对短直链烷烃的降解率>90%，对大部分中直链烷烃的降解率只有50%左右，而在长直链烷烃的降解率上较菌株BGQ-6有明显优势，对大部分支链烷烃的降解率都在50%左右，只有对2-methyl-octadecane(碳原子数为19)的降解率较低，为4.68%。DX-7和菌株BGQ-6对环烷烃的降解率几乎一致，均为50%左右，对不饱和烃降解率最高。　　⑶利用不同引物对菌株BGQ-6和DX-7基因组中与烷烃降解相关的基因进行PCR，结果表明这两株菌中都含有alkB（编码烷烃羟化酶)和almA（编码黄素单加氧酶)基因，而不含有P450（编码细胞色素)、ndoB（编码萘双加氧酶)和xylE（编码2，3-邻苯二酚双加氧酶)基因。通过构建克隆文库确定了菌株BGQ-6基因组中存在4个alkB家族成员和1个almA基因拷贝，GenBank登录号分别为 alkB1(HG530382)、alkB2(HG530385)、alkB3(HG530379)、alkB4(HG530384)和almA(HG530364)。系统发育分析表明alkB1、alkB2和alkB4分别与同属中的三个菌株最相似，相似度都在90%以上；alkB3与Geobacillus subterraneus中的alkB基因相似性为93%；而almA与其相似度最高的almA相似值仅为73%且覆盖度不到50%。DX-7基因组中分别有1个alkB基因拷贝和1个almA基因拷贝，登录号分别为alkB(HG530364)和almA(KF802199)。　　⑷此次研究共筛选出6株不动杆菌，通过对不动杆菌属两个特殊看家基因rpoB和gyrB的检测，分离自沱沱河和唐古拉山的两株不动杆菌为潜在新种，其编号分别为TTH0-4和TGL-Y2。对TTH0-4株菌进行了鉴定，通过DNA-DNA杂交实验确定该菌为新种，并借助Biolog GEN III鉴定板API20NE和API ZYM，以及扫描电镜等手段获得了该菌株的形态特征和部分生理生化指标。