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目的:Priostin(POSTN)是动物体内成骨细胞和成纤维细胞分泌的一种细胞外分泌蛋白,在多种生理及病理状态下均会表达,病理状态下尤为显著。急性肺损伤(Acute Lung Injury.ALI)是一种肺组织的系统性炎症,常见原因有脓毒症、重症肺炎及创伤等。治疗不当或不及时可增加患者急性呼吸窘迫综合症(Acute Respiratory Distress Syndrome.ARDS)的发生率,且此类患者的死亡率较高,目前尚无显著高效的总体治疗策略,因此对于急性肺损伤的研究仍然有很强的必要性。有研究表明血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ.AngⅡ)受体拮抗剂能降低大鼠体内POSTN表达水平。本研究通过在大鼠体内应用AngⅡ受体拮抗剂缬沙坦来降低ALI大鼠肺组织POSTN的表达,来探讨缬沙坦是否能够保护脓毒症导致的急性肺损伤大鼠的肺脏。方法:1.ALI模型建立及动物分组:体重分布200-320g的45只SPF级S-D大鼠按照随机数表法分为空白对照组,脂多糖实验组(LPS组),缬沙坦低量干预组(10只)、缬沙坦中剂量干预组(10只)和缬沙坦高剂量干预组(10只)。动物称重后记录数据,对照组给予1ml无菌生理盐水经大鼠尾静脉注入,其余4组按照每公斤体重5mg LPS溶入1ml生理盐水中经大鼠尾静脉注入,缬沙坦干预组分别按照每公斤体重40mg、80mg、120mg腹腔注射缬沙坦混悬液。2.标本留取:各组大鼠经上述处置后正常喂食喂水,模型建立后6h麻醉处死大鼠,取大鼠右肺上叶放在-80℃冰箱中保存,用于实时定量PCR(RT-PCR)来检测肺组织periostin的表达程度。右肺下叶用于测肺组织干湿重比,用止血钳夹住主气管,用磷酸盐溶液反复冲洗支气管及肺泡多次,留取肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid.BALF),BALF离心后留取上清于-20℃冰箱中保存,留作炎症因子检测。将左叶肺组织放入中性甲醛溶液中,中性甲醛溶液起到组织固定作用。用HE染色制作组织病理标本。从腹主静脉抽取血液,经离心机离心后取上清液置于-80℃冰箱中。用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-13、TNF-α在BALF中的含量。3.湿干重比的测量:将取出的大鼠右肺下叶放入烤箱中,烤箱设置温度为80℃,持续烘烤24h后,应用微量电子称称重并记录。4.组织病理学检测:取出固定完全的肺组织,常规石蜡包埋,采用HE染色,应用电子显微镜观察肺部组织炎症反应的程度。5.实时荧光定量PCR(Real-Rime PCR)检测periostin mRNA在肺组织中的表达Periostin mRNA的表达:首先提取肺组织中的总mRNA,然后根据RT-PCR试剂盒提供的产品说明书在反应体系内加入实验所需的各种试剂。设定PCR的反应条件,进行逆转录循环,循环45次后,反应体系在72℃继续延伸10分钟。根据Gen Bank中大鼠的periostin(基因登录号NM001108550)及β-actin(基因登录号NM031144)序列设计引物。Periostin上游引物为5’-AGGAGCCGTGTTTGAGACCAT-3’下游引物为5’-CGGTGAAAGTGGTTTGCTGTTT-3’β-actin上游引物为5’-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3’下游引物为5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’。将反应结果采用相对定量的方法在荧光定量仪进行分析。以β-actin基因mRNA的表达为内参基因,根据公式计算相对表达量的差值,即为2-△△Ct,2-△△Ct的意义为实验组的目的基因的表达相对于对照组的表达倍数。6.Western Blot方法测量肺组织中periostin蛋白含量:将肺组织取出后在冰面上用组织研磨器进行研磨,研磨完成后,应用试剂盒提供的说明书测量肺组织中总蛋白得浓度,统一浓度后,进行电泳,转膜,封闭,抗体杂交,发光后凝胶成像,采取图样。7.用ELISA法检测炎症因子IL-4、IL-13及TNF-α在BALF中的浓度。8.数据统计分析:本研究中实验数据均采用SPSS18软件进行统计学分析及处理。规定P<0.05时,可认为比较各组间的差异具有统计学意义。结果:(一)各组大鼠右下肺叶的湿/干重比值与正常对照组(4.01±1.14)相比,LPS组大鼠肺组织湿/干重比(5.36±0.30)明显升高,差异显著,有统计学意义(p<0.05),说明模型的制作是成功的。缬沙坦低(4.91±0.15)、中(4.81±0.10)、高(4.85±0.11)干预组之间差异无统计学意义(p>0.05)。缬沙坦干预组与LPS组差异具有统计学意义(p<0.05)。(二)组织病理学检测用光学显微镜在高倍镜下观察病理切片,可见正常组大鼠肺组织结构清晰,细胞大小正常,肺泡间隔正常,肺泡腔内炎症细胞的浸润较少,无肺组织明显水肿。急性肺损伤组大鼠肺组织可见肺泡间隔明显消失并呈明显增厚表现,组织可见大量出血点及水肿,肺泡腔内可见异常大量炎症细胞的浸润。缬沙坦干预组上述病理改变比LPS组大鼠表现有轻度减少。(三)RT-PCR检测肺组织PeriostinmRNA的表达水平应用相对定量的计算办法,以β-action为内参基因,结果以LPS组目的基因periostin mRNA的表达相对于内参基因的变化倍数表示。结果分析,LPS实验组相对于空白对照组比较,LPS组结果升高明显,差异显著,差异具有统计学意义;缬沙坦干预组(低、中、高)与LPS组相对表达量差异具有统计学意义。(四)肺组织Periostin蛋白Western Blot检测肺组织Western Blot检测,根据凝胶成像分析系统检测,其相应条带对应蛋白含量=(样品条带的光密度×面积)/(GAPDH的光密度×面积)。肺组织periostin蛋白含量:相对于对照组,LPS组大鼠肺组织periostin蛋白含量明显增高(2.48±0.07vs0.74±0.05,p<0.05);相对于对照组,缬沙坦干预组大鼠肺组织periostin蛋白含量差异具有统计学意义(1.43±0.03vs0.74±0.05、1.65±0.07vs0.74±0.05、1.48±0.04vs0.74±0.05,p<0.05),缬沙坦低、中、高剂量干预组组间比较,periostin蛋白含量差异无统计学意义(1.43±0.03vs1.65±0.07vs1.48±0.04,p>0.05)。(五)BALF中炎症因子IL-6、IL-13、TNF-α的含量与对照组相比(170±19)pg/ml,LPS组大鼠的BALF中IL-6的含量(310±37)pg/ml升高明显,差异有统计学意义(p<0.05),干预组与LPS组相比差异有统计学意义(p<0.05)。与对照组相比(83±8)pg/ml,LPS组大鼠的BALF中IL-13的含量(53±9)pg/ml降低明显,差异有统计学意义(p<0.05),干预组与LPS组相比差异有统计学意义(p<0.05)。与对照组相比(149±12)pg/ml,LPS组大鼠的BALF中TNF-α含量(280±40)pg/ml呈明显升高,差异有统计学意义(p<0.05),干预组与LPS组相比差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.急性肺损伤大鼠肺组织中的POSTN表达水平明显升高。2.缬沙坦可以通过拮抗AngⅡ受体来降低POSTN的表达,从而降低肺组织的炎症反应及水肿程度,也就是降低了ALI大鼠肺组织的损伤程度,起到肺保护作用。说明缬沙坦对脓毒症导致的ALI有一定的保护作用。