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目的:胞外多糖(EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外的一类多糖物质,具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎等多种生物活性。海南医学院裴华老师等人从海南红树林热带湿地海洋环境中分离到一株淡紫拟青霉菌,我们从中提取得到了该菌的胞外多糖(称为PH-EPS)。巨噬细胞作为机体抗感染的第一道防线及肿瘤免疫的主要效应细胞之一,在机体的免疫中起着至关重要的作用。本课题主要研究PH-EPS对巨噬细胞的免疫调节活性及其机制。方法:本研究选用巨噬细胞RAW264.7细胞株作为试验对象,将不同浓度的PH-EPS和巨噬细胞共培养24 h后用MTT检测巨噬细胞存活率,获得作用于RAW264.7细胞的最佳浓度范围;将不同浓度的PH-EPS作用于RAW264.7细胞后检测培养液中NO的含量;不同浓度PH-EPS作用于RAW264.7细胞后将其裂解并用Western blotting检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IκB-α及MAPK通路的蛋白磷酸化水平;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的浓度;通过流式细胞仪检测RAW264.7细胞对右旋糖酐的摄取来反映RAW264.7细胞的吞噬功能状态;采用激光共聚焦显微镜观察PH-EPS处理RAW264.7细胞后NF-κB p65由细胞质向细胞核转移情况,同时采用NF-κb、TLR2、TLR4、Dectin-1和CR3抑制剂来进一步验证RAW264.7细胞激活与NF-κB/MAPK信号通路的关系。结果:MTT结果表明,PH-EPS在浓度在0μg/ml~600μg/ml时对RAW264.7细胞的存活率无显著影响,检测细胞培养液中NO的含量发现PH-EPS可促进RAW264.7细胞产生并释放NO,并且呈剂量依赖效应。LPS的抑制剂多粘菌素B(PMB)和PH-EPS同时处理RAW264.7细胞发现RAW264.7细胞分泌NO的水平没有改变,说明PH-EPS诱导RAW264.7细胞产生NO与内毒素污染无关。用Western blotting(WB)检测发现,PH-EPS能促使RAW264.7细胞高表达NO诱导酶iNOS,并呈剂量依赖效应效应,说明PH-EPS可能通过上调iNOS的表达来促进RAW264.7细胞NO产生。用ELISA检测发现PH-EPS能显著提高RAW264.7细胞中TNF-α和IL-1β含量并呈剂量依赖效应。随后,通过流式细胞仪检测RAW264.7细胞吞噬FITC标记的右旋糖酐后的荧光强度,发现PH-EPS处理后RAW264.7细胞荧光强度明显增强并呈剂量依赖效应,说明PH-EPS能增强RAW264.7细胞的吞噬能力。为了进一步了解PH-EPS激活RAW264.7巨噬细胞机制,我们用激光共聚焦显微镜观察发现PH-EPS处理的RAW264.7细胞中有明显的NF-κB p65由细胞质向细胞核转移的荧光,用Western blotting检测IκB-α蛋白发现PH-EPS处理的RAW264.7细胞IκB-α蛋白表达则明显下调,更进一步用NF-κB抑制剂PDTC和BAY11-7082阻断NF-κB通路激活后,发现PH-EPS处理的RAW264.7细胞表达TNF-α和IL-1β水平则明显下降,说明NF-κB信号通路参与了PH-EPS介导的RAW264.7细胞的活化。此后,我们用Western blotting检测还发现PH-EPS处理的RAW264.7细胞中MAPK通路的三个主要级联蛋白ERK、JNK、p38磷酸化水平都明显增加,相反用MAPK抑制剂作用后,巨噬细胞培养液中TNF-α和IL-1β的含量也显著减少,表明MAPK信号通路也参与了PH-EPS介导的RAW264.7细胞的激活。最后我们用抗TLR2、TLR4、Dectin-1和CR3抗体和PH-EPS共同处理RAW264.7细胞,然后用ELISA检测TNF-α和IL-1β含量,发现阻断TLR4和Dectin-1通路后细胞分泌TNF-α和IL-1β有明显下降,说明TLR4和Dectin-1参与了PH-EPS诱导的RAW264.7细胞激化。结论:以上实验结果表明,淡紫拟青霉菌胞外多糖(PH-EPS)能调节活化巨噬细胞,激活并促进其炎症过程和吞噬活性;TLR4/NF-κB/MAPKs信号通路活化是PH-EPS激活巨噬细胞的重要分子机制。