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研究背景卵巢恶性肿瘤是女性生殖道三大恶性肿瘤之一,其中85-90%为上皮性卵巢癌,上皮性卵巢癌在女性生殖道恶性肿瘤中死亡率最高, 75%以上的患者初诊时已发展到中晚期,临床治疗主要采用手术切除及联合化疗,5年生存率在30%左右,至少70%患者会复发。卵巢癌发病机制不清,早期诊断困难,化疗耐药等多因素造成了卵巢癌治疗效果差。近年来的研究认为DNA损伤应答反应( DNA damage response ,DDR)系统对肿瘤的发生、发展及治疗具有重要的作用,DDR功能紊乱是细胞癌变的关键因素,DDR因促进肿瘤细胞DNA损伤修复而降低了化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,与肿瘤耐药和复发密切相关。DDR是一个复杂的调控系统,主要包括:感应DNA损伤,通过对细胞周期的调控,让细胞周期阻滞在某个时相对DNA损伤进行修复,并调节凋亡和衰老,其中细胞周期的调控在DDR系统中起着核心作用。通过深入研究细胞周期的调控机制,并寻找细胞周期的调控机制中的关键因子作为抗癌治疗的靶点,是目前肿瘤治疗研究的热点之一。细胞周期检测点激酶Chk1和细胞周期素依赖性激酶抑制因子p57/kip2是细胞周期中的两个关键调控因子,均可调控细胞周期检测点,参与了肿瘤细胞增殖、修复和凋亡,与肿瘤发生、发展、侵袭转移有关。目的Chk1和p57/kip2对人卵巢癌细胞SKOV3及HO8910细胞周期调控的影响及机制研究。方法第一部分:设计合成3段Chk1siRNA靶向干扰化学片段;分别转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910,48h后用RT-PCR方法检测Chk1mRNA表达,Western-blot方法检测Chk1蛋白表达,筛选出能抑制Chk1表达的有效siRNA片段;将筛选出Chk1siRNA片段转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910,48h后用流式细胞术检测转染Chk1siRNA与未转染Chk1siRNA细胞SKOV3、HO8910的细胞周期分布情况;用RT-PCR方法和Western-blot方法分别检测细胞周期相关基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27、Cdc25AmRNA和蛋白表达。第二部分:构建p57过表达质粒;转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910, 48h后用流式细胞术检测转染p57过表达质粒与未转染p57过表达质粒细胞SKOV3、HO8910的细胞周期分布情况;用RT-PCR方法和Western-blot方法分别检测p57及细胞周期相关基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27、Cdc25AmRNA和蛋白表达。第三部分:用SP免疫组化法检测Chk1和p57/kip2在人浆液性和粘液性卵巢肿瘤组织中的表达。结果第一部分:Chk1siRNA靶向干扰人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910Chk1表达,可抑制Chk1G2/M细胞周期检测点阻滞功能;增强细胞周期相关基因CyclinA、CyclinE、CDK2mRNA、Cdc25A和蛋白表达,减弱p21、p27mRNA和蛋白表达,而对CyclinD1、CDK4mRNA和蛋白表达无影响。第二部分: p57过表达质粒转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910增加p57表达,可增强p57G1/S细胞周期检测点阻滞功能;抑制细胞周期相关基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2 mRNA和蛋白表达,而对CDK4、p21、p27、Cdc25A mRNA和蛋白表达无影响。第三部分:在人恶性上皮性卵巢肿瘤组织中Chk1阳性表达率为89.13%(41/46),明显低于交界性上皮性肿瘤(P<0.05);p57在人恶性上皮性卵巢肿瘤组织中阳性表达率为36.96%(17/46);明显高于恶性上皮性肿瘤(P<0.05)。结论1 Chk1对人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910G2/M细胞周期检测点有阻滞作用,靶向抑制Chk1可上调下游基因CyclinA、CyclinE、CDK2、Cdc25AmRNA和蛋白表达,下调下游基因p21、p27mRNA和蛋白表达。2 p57对人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910G1/S细胞周期检测点具有阻滞作用,p57过表达可抑制下游基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2 mRNA和蛋白表达。3在人上皮性卵巢肿瘤组织中,Chk1在恶性上皮性肿瘤组织中表达明显高于良性和交界性肿瘤,p57在恶性上皮性肿瘤组织中表达明显低于良性和交界性肿瘤。