背景与目的骨骼系统转移是晚期乳腺癌常见并发症,也是导致乳腺癌患者生活质量下降和生存寿命减少的主要原因。在原发灶、循环和转移灶三个与转移相关的微环境中,骨微环境内的细胞成分(如破骨细胞和骨细胞)与乳腺癌细胞相互作用,形成恶性循环过程,促进乳腺癌细胞在局部骨微环境的定植生长和对骨的破坏,导致顽固性疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫等骨骼相关表现(Skeletal-related events,SREs)的发生。唑坐来膦酸是治疗SREs的首选药物,但其主要作用靶点为破骨细胞,对乳腺癌细胞本身的效果仍存在争议。因此,如何同时靶向肿瘤细胞,并达到在局部骨破坏病灶的高浓度药物缓释是亟待解决的热点问题。本课题拟利用天然中药小分子化合物白花丹素,将其与唑来膦酸联合使用,观察二者在乳腺癌骨转移过程中是否具有协同作用,分析其协同作用机制;进而建立以唑来膦酸为靶头,负载白花丹素并pH响应释放的新型掺钆上转化纳米颗粒载药体系,在实现核磁和光学双模态成像发现早期乳腺癌骨转移灶的同时进行治疗,达到诊疗一体化效果,以期为早期乳腺癌骨转移的诊治提供全新的手段和药物。材料与方法1.体外观察白花丹素和唑来膦酸联合使用对乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响,分析两药联合是否具有协同效应,探讨两药联合的协同抗肿瘤机制;建立胫骨内注射乳腺癌细胞动物模型,利用小动物活体成像技术(IVIS)和组织切片染色观察两药联合的体内抗肿瘤疗效。2.体外观察白花丹素和唑来膦酸联合使用对破骨前体细胞增殖和分化的影响,评价是否可阻断乳腺癌条件培养基诱导的破骨细胞成熟,探索两药联合的协同抗破骨细胞活化机制;建立胫骨内注射乳腺癌细胞动物模型,利用X线(X-ray)/显微CT(μCT)、ELISA和组织学手段观察两药联合的体内抗骨破坏疗效。3.建立唑来膦酸为靶头,负载白花丹素并pH响应释放的新型双模态掺钆上转化纳米体系,系统评价其作为诊治材料本身的纳米颗粒性能,探讨其对骨细胞诱导的破骨细胞发生作用及其机制。建立心内注射乳腺癌细胞骨转移动物模型,利用X-ray/IVIS/上转化荧光/MR/μCT、组织学、扫描电镜和能谱分析手段观察纳米颗粒的体内诊疗一体化效果及体内骨细胞靶向效率。结果1.白花丹素和唑来膦酸联合使用在体外可协同抑制乳腺癌增殖和迁移,促进乳腺癌细胞凋亡。两药联合使用可协同降低活性PARP和Bcl-2表达,促进ID1、p21和cleaved caspase-3表达,同时通过Notch-l-Bcl-2信号通路协同促进乳腺癌细胞凋亡。在胫骨内注射乳腺癌细胞动物模型内,两药协同抑制骨微环境内乳腺癌细胞细胞定植生长,促进乳腺癌细胞在骨微环境内的凋亡。2.白花丹素和唑来膦酸联合使用在体外可协同抑制破骨前体细胞增殖。两药联合协同抑制RANKL和乳腺癌细胞条件培养基诱导的破骨细胞成熟分化,主要通过结构模拟磷酸腺苷ANP,竞争性结合Erk/Jnk激酶并抑制其磷酸化,进而抑制NF-κB/MAPK激活,下调Erk/Jnk激酶下游c-Fos、c-Jun和NFATcl蛋白表达。两药在体内协同抑制肿瘤相关破骨细胞激活和溶骨性缺损发生。3.新型骨靶向上转化纳米颗粒可减少骨细胞分泌RANKL及Sclerostin,体外抑制骨细胞诱导的破骨细胞发生。在心内注射乳腺癌细胞骨转移动物模型,双模态成像纳米颗粒可较X-ray检查更早发现骨微转移灶,同时通过负载药物抑制乳腺癌细胞在局部骨微环境内的定植及相关的溶骨性病损发生。结论1.白花丹素和唑来膦酸联合使用协同抑制乳腺癌细胞在体外和体内微环境中的生长,主要机制为通过Notch-l-Bcl-2信号通路促进乳腺癌细胞凋亡。2.白花丹素和唑来膦酸联合使用协同抑制乳腺癌细胞对破骨细胞的激活和骨破坏的发生,主要机制通过两药联合模拟ANP,竞争性抑制其与靶激酶Erk/Jnk结合及磷酸化,抑制破骨细胞分化成熟。3.心内注射乳腺癌细胞动物模型研究提示,唑来膦酸为靶头、负载白花丹素的pH控释骨靶向上转化纳米颗粒可早期发现骨微转移灶,并通过负载药物靶向微环境内的骨细胞-破骨细胞-肿瘤细胞网络,抑制乳腺癌骨转移的发生,达到诊疗一体化效果。