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目的:疟疾是一种由蚊虫传播的传染性疾病,是世界上重要的公共卫生问题之一。WHO报道,2018年,全球约有2.28亿病例,大约40.5万例患者死于疟疾。尽管疟疾根除工作已经取得了相当大的进展,但是还有很多因素导致疟疾根除受到阻碍。近年来的研究提示,疟原虫侵入机体后为逃避宿主的免疫攻击,进化出了较为完善的机制,可以通过多种途径逃逸宿主免疫系统攻击,其中包括疟原虫表达模拟宿主的免疫分子、疟原虫抗性基因的多态性和高度可变性、疟疾感染后宿主免疫系统抑制等。其中,分子模拟现象提供了疟原虫一种新的免疫逃避机制。寄生虫在其漫长的进化中始终保留了与宿主特征相似的同源分子,可能是由于这类分子可以逃避宿主的攻击,进而有利于自身的生存、繁衍和传播。T 细胞免疫调节蛋白(T cell immunomodulatory protein,TIP)是一种近年来发现的存在于人和多种动物体内的免疫调节分子,它是由612个氨基酸组成的跨膜蛋白。生物信息学分析发现,在多种疟原虫中都存在与TIP结构相似的蛋白,然而,疟原虫TIP样蛋白和TIP在功能上是否存在较高的相似性,能否抑制宿主对疟原虫的免疫攻击能力等问题尚不清楚。本课题组主要研究伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白(Plasmodium berghei TIP,PbTIP)在疟原虫感染宿主过程中的免疫作用,课题组先前研究分析发现,PbTIP是伯氏疟原虫高度保守的一类特异性膜蛋白,存在于整个疟原虫生命周期,验证了它在体内对宿主具有一定的免疫调节作用,但PbTIP对树突细胞等免疫细胞的作用尚不清楚。树突状细胞(Dendritic Cell,DC)是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell,APC),分布在身体的淋巴和非淋巴组织中,参与初始和适应性免疫应答。尽管DC仅在人外周血占单个核细胞的 1%左右,但是它们广泛分布于外周组织,作为免疫哨兵不断的巡查和提取环境抗原。DC可以启动免疫应答进而控制和消除病原体。DC在通过刺激天然T细胞启动获得性免疫和诱导自我耐受的过程中起重要作用,表明在广泛的免疫过程中,DC作为一种重要的免疫调节剂参与免疫反应。本次实验的目的是在体外用PbTIP全基因序列的重组蛋白(以下用rPbTIP表示)和课题组获得的trPbTIP,分别刺激DC2.4细胞。通过检测DC2.4细胞的增殖情况、DC细胞信号分子和细胞因子水平变化,探讨在体外PbTIP能否对DC细胞发挥免疫调节作用,从而刺激DC细胞发挥免疫调节作用,为疟疾防治、研发新型高效的疟疾疫苗和寻求疟原虫治疗的新靶点提供新思路、新方向。研究方法:1、trPbTIP的来源课题组先前用 SMART生物信息学软件与 NCBI大数据库对PbTIP结构域进行预测,筛选出VCBS 区域选择胞外表达的膜蛋白区域,且保证该区域无信号肽、跨膜区与低复杂区域干扰,最终确定204-335 aa来表达PbTIP片段蛋白(trPbTIP),在体外合成了 trPbTIP验证了它的生物活性,以及在脑疟发展过程中发挥的作用。2、rPbTIP目的基因的获取及表达载体的构建利用生物信息学预测软件对疟原虫TIP样蛋白的同源性等进行生物信息学分析,获取小鼠PbTIP全基因序列信息,委托金斯瑞生物科技有限公司合成PbTIP全基因片段,并克隆载入原核pET32a(+)-rPbTIP和pET28a-MBP-rPbTIP表达载体,分别用两种载体表达rPbTIP蛋白,选择稳定性好、表达量高的载体进行后续实验。3、rPbTIP重组蛋白的表达与纯化将正确测序的原核表达载体 pET32a(+)-rPbTIP 和pET28a-MBP-rPbTIP 转化入 E.coli BL-21 中,经 IPTG 诱导表达rPbTIP,选取表达rPbTIP量多、纯度高的载体所表达rPbTIP,收集纯化带标签rPbTIP,经TEV消化后去除标签蛋白MBP,然后纯化、收集rPbTIP,用SDS-PAGE和LC-MS/MS(序列覆盖)进行验证蛋白纯度与分子量大小。4、CCK-8检测PbTIP最佳作用时间及浓度将DC2.4用96孔板,每孔1×104/mL,培养24小时后加入trPbTIP和rPbTIP并调整培养体积为100 μl/孔,并使trPbTIP和rPbTIP浓度分别为 1.0ng/mL、10.0ng/mL、100.0ng/mL,同时设空白孔(1640 培养液)、未刺激孔(DC alone)和LPS诱导的阳性对照孔(LPS浓度为10μg/mL),继续培养24h、48h、72h。在培养结束前4h,每孔加入10μl的CCK-8试剂,均匀,继续培养4小时。避光,在酶标仪上以450nm波长测量吸光度(OD值)。5、RT-PCR检测PbTIP作用后的DC2.4信号变化将DC细胞以105/mL浓度接种到6孔板内,根据CCK-8实验结果选取浓度为 1.0ng/mL和 100.0ng/mL的trPbTIP和rPbTIP刺激DC2.4细胞,10μg/mL的LPS刺激DC2.4细胞作为阳性对照组,培养时间为48h,然后收集各组培养上清进行细胞因子检测,收集细胞,按照传统 Trizol法提取RNA,测定RNA的浓度及OD值。反转录获得各组cDNA。用获得的上述各样品cDNA为模板,应用各自引物进行 RT-PCR 反应,比较各组间 MyD88、NF-κB、TLR9、TLR4 的 mRNA含量是否有差异。6、细胞因子的检测将收集到的不同实验组的DC2.4培养上清液,遵照R&D Systems ELISA试剂盒操作步骤,分别检测IL-10、TNF-α、TGF-β和IFN-γ四种细胞因子,使用酶标仪在450nm处检测各指标OD值,根据试剂盒内所配标准品绘制标准曲线并计算出各实验组细胞因子的浓度。7、统计学分析数据以均数±标准差(X±SD)表示,采用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行处理,组间组内差异采用独立样本t检验或单因素方差分析,P<0.05表示有统计学差异,P<0.001表示有明显差异。结果:1、目的基因的获取及表达载体的构建根据疟原虫数据库PlasmoDB最新公布的小鼠PbTIP全基因序列信息,委托金瑞斯生物有限公司合成PbTIP胞外域全基因片段,并克隆入原核表达载体 pET32a(+)和 pET28a-MBP,测序结果与Genebank中公布的序列进行比对,结果一致,酶切法鉴定结果也显示,目的基因片段大小约为1200bp,与预期结果相符,证明rPbTIP蛋白表达载体pET32a(+)-rPbTIP和pET28a-MBP-rPbTIP两种载体构建正确。2、重组蛋白的表达将PbTIP蛋白表达载体转入E.coli BL-21中,诱导表达后发现,胞外重组蛋白 TIP在 pET28a-MBP克隆和 BL-21(DE3)表达比pET32a(+)克隆和表达BL-21(DE3)结果好,且最佳条件是在15℃下诱导16小时,在细胞裂解上清液中,rPbTIP含量最高。3、重组蛋白的纯化经两步纯化得到带标签的rPbTIP,TEV酶与rPbTIP蛋白比例为1:20时消化,室温消化2h,去除MBP标签蛋白后收集蛋白,采用SDS-PAGE和LC-MS/MS(序列覆盖)确证法测定蛋白纯度约为85%,分子量都正确。应用BSA试剂盒检测收集所得的rPbTIP蛋白,绘制的量化-BSA标准曲线,计算得rPbTIP蛋白的浓度为0.15mg/mL。4、CCK-8检测PbTIP最佳作用时间及浓度PbTIP蛋白对DC2.4细胞的最佳作用时间是48h,24h时细胞生长不旺盛,各组间未见差异,而72h时细胞生长过剩,各组间比较,P>0.05,无统计学意义。浓度1ng/mL的rPbTIP蛋白对DC2.4细胞增殖有一定的促进作用,P<0.01,差异有统计学意义;浓度100ng/mL的rPbTIP蛋白对DC2.4细胞增殖有抑制作用,P<0.01,差异有统计学意义。trPbTIP蛋白所得结果与rPbTIP蛋白基本一致。5、RT-PCR检测PbTIP作用后的DC2.4信号变化浓度100ng/mL的trPbTIP抑制DC2.4细胞后可以使DC2.4细胞MyD88、NF-κB、TLR9的mRNA表达水平增高,P<0.001,差异有统计学意义,而TLR4 的mRNA无明显表达;浓度100ng/mL的rPbTIP抑制DC2.4细胞后可以使其表面NF-κB的mRNA表达水平增高,P<0.001,差异有统计学意义,而MyD88、TLR4、TLR9的mRNA无明显表达。6、细胞因子的检测PbTIP蛋白对DC2.4细胞分泌IFN-γ、TGF-β和IL-10等细胞因子的水平无明显影响。但浓度100ng/mL的 rPbTIP蛋白促进DC分泌TNF-α的水平增加,P<0.001,差异有统计学意义;浓度分别为1ng/mL和100ng/mL的trPbTIP刺激DC2.4分泌TNF-α的量比阴性对照组均有所增加P<0.001,差异有统计学意义,且浓度 1ng/mL的trPbTIP作用更明显。结论:1、低浓度rPbTIP和trPbTIP可以促进DC的增殖;高浓度rPbTIP和trPbTIP可以抑制DC的增殖;2、trPbTIP 调节 DC 信号分子 NF-κB、MyD88、TLR9 的 RNA 水平升高;rPbTIP调节DC信号分子NF-κB的RNA水平升高。3、高浓度rPbTIP刺激DC分泌TNF-α的水平增高;trPbTIP也可以刺激DC分泌TNF-α的水平增高。