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目的:血小板衍生生长因子(PDGF)或10%胎牛血清(FBS)刺激血管平滑肌细胞(VSMC),造成增殖、抗凋亡模型,观察花刺参粘多糖及其复方制剂对原代培养的大鼠VSMC增殖、凋亡及VSMC表型转化的影响。
方法:用组织块法原代培养雄性Wistar大鼠胸主动脉中膜平滑肌细胞,传代细胞(5-7代)经10%FBS的DMEM培养液静止培养24h,0.5%FBS的DMEM培养液血清饥饿(使其同步化于G0/G1期)24h后,随机分为对照组、模型组、花刺参粘多糖(ST)组、复方花刺参粘多糖(复方ST)组、辛伐他汀组五组。实验分为PDGF和FBS两种刺激模型,对照组只加含0.5%FBS的DMEM培养液。PDGF模型组:0.5%FBS的DMEM培养液+PDGF-BB(终浓度达到20ng/m1),FBS模型组:0.5%FBS的DMEM培养液+10%FBS;ST组在PDGF或FBS模型组的基础上加入ST(大剂量20mg/ml、小剂量5mg/ml);复方ST组在PDGF或FBS模型组的基础上加复方ST(大、中、小剂量组分别含中药提取物终浓度为60mg/ml、30mg/ml、10mg/m1);辛伐他汀组在PDGF或FBS模型组的基础上加辛伐他汀10umol/L。作用24h后,1)MTT法酶标仪观测各组细胞吸光度值(OD值)。2)流式细胞计数观察各组细胞周期变化;3)用TUNEL、流式细胞计数两种方法观察药物对细胞凋亡率的影响;4)RT-PCR半定量测定细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和骨桥蛋白mRNA表达情况。实验数据采用SPSS11.0软件作统计学处理。
结果1.ST及复方ST对VSMC增殖的影响(MTT)(1)用PDGF刺激增殖模型中,ST大剂量组(0.187±0.017)、复方ST大剂量组(0.155±0.007)、中剂量组(0.292±0.065)OD值显著低于模型组(0.406±0.003),P<0.01;此三组OD值与辛伐他汀组(0.347±0.024)相比,差异无统计学意义。
(2)用FBS刺激的增殖模型中,复方ST大、中、小剂量组(OD值分别为0.286±0.015、0.408±0.021、0.445±0.020)、辛伐他汀组(0.419±0.011)、ST大剂量组(0.369±0.019)OD值均显著低于模型组(0.484±0.034),P<0.05,且复方ST各组OD值呈剂量依赖性降低。复方ST大剂量组、ST大剂量组OD值显著低于辛伐他汀组,P<0.01。
2.ST及复方ST对VSMC细胞周期的影响(1)在PDGF模型中,复方ST组(90.3%±6.9%)、辛伐他汀组(87.5%±6.1%)、ST组(88.1%±5.3%)G0/G1期细胞比例显著高于模型组(77.4%±5.7%),P<0.05,S期细胞比例比模型组明显减少(分别为6.3%±6.8%,6.7%±4.0%,6.3%±3.3%vs14.8%±2.4%);G0/G1期、S期细胞比例在各药物组间比较均无统计学差异。
(2)在FBS刺激模型中,G0/G1期细胞比例复方ST组、辛伐他汀组、ST组显著高于模型组(分别为69.9%±0.1%、71.8%±2.4%、75.8%±1.8%vs54.7%±12.7%),P<0.05;各药物组间G0/G1期细胞比例无统计学差异;辛伐他汀组、ST组S期细胞比例较模型组减少(14.1%±6.7%、13.9%±1.8%vs32.5%±10.9%,P<0.05),而复方ST组(19.6%±2.8%)与模型组比较无统计学差异。
3.ST及复方ST对VSMC细胞凋亡的影响(1)流式细胞仪计数结果在PDGF模型中,复方ST组(26.8%±10.8%)、辛伐他汀组(27.0%±9.1%)、ST组(22.6%±2.3%)细胞凋亡率明显高于模型组(8.6%±2.3%),P<0.05。复方ST组、ST组凋亡率与辛伐他汀组相比皆无统计学差异。
在FBS模型中,复方ST组(18.62%±2.46%)、辛伐他汀组(26.59%±2.30%)、ST组(13.51%±2.75%)细胞凋亡率明显高于模型组(2.84%±1.44%),P<0.01。复方ST组、ST组凋亡率与辛伐他汀组相比明显降低(P<0.01)。
(2)TUNEL检测结果在PDGF模型中,复方ST组(14.9%±0.90~)、辛伐他汀组(9.7%±1.01%)、ST组(10.1%±0.90%)凋亡细胞比例比模型组(2.7%±0.39%)显著增高,P<0.01。复方ST组凋亡细胞比例显著高于辛伐他汀组(P<0.01)。
在FBS模型中,,复方ST组(7.8%±2.03%)、辛伐他汀组(11.1%±1.29%)、ST组(8.6%±1.13%)凋亡细胞比例与模型组(2.9%±1.05%)相比显著增高,P<0.01。与辛伐他汀组相比,复方ST组、ST组凋亡细胞比例显著降低(P<0.05)。
4.ST及复方ST对VSMC骨桥蛋白mRNA表达的影响(1)在PDGF模型中,复方ST组、ST组细胞骨桥蛋白mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.01);与辛伐他汀组相比,复方ST组、ST组细胞骨桥蛋白mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。
(2)在FBS模型中,复方ST组、ST组细胞骨桥蛋白mRNA表达水平显著低于模型组相比,P<0.05。与辛伐他汀组相比,复方ST组细胞骨桥蛋白mRNA表达水平降低,P<0.05,而ST组与辛伐他汀组相比无统计学差异。
5.ST及复方ST对VSMCα-SMAmRNA表达的影响在PDGF或10%FBS刺激后,α-SMAmRNA表达无明显差异;与模型组相比,ST、复方ST、辛伐他汀对细胞α-SMAmRNA表达水平无统计学差异。
结论1.复方ST及ST在体外能有效抑制PDGF-BB或10%FBS刺激的大鼠VSMC细胞增殖。
2.复方ST及ST可显著地抑制PDGF-BB或10%FBS对VSMC的抗凋亡作用,促进体外VSMC的凋亡。
3.复方ST及ST有效逆转PDGF和10%FBS刺激的细胞骨桥蛋白mRNA高表达,提示复方ST及ST可能具有抑制VSMC迁移及抑制细胞从收缩型向合成型转变的作用。
4.复方ST及ST对VSMC细胞骨架蛋白α-SMAmRNA可能无影响。
5.通过抑制VSMC增殖,促进细胞凋亡,逆转骨桥蛋白的高表达,复方ST及ST对防治PTCA术后再狭窄有临床开发前景。