研究背景:香烟中含有约4000余种化合物,尼古丁是其重要成分和主要成瘾物质。香烟替代产品如尼古丁贴片、尼古丁口香糖、电子烟的主要成分也是尼古丁。有大量的文献报道尼古丁影响成骨细胞、破骨细胞的正常生理功能。令人感到吃惊的是,虽然体内实验证实尼古丁可以造成骨折愈合障碍,骨密度下降,但是一些学者在体外实验中发现,在低浓度下尼古丁对成骨细胞的分化和成骨功能不产生影响甚至有促进作用。因此尼古丁通过何种机制干扰骨折正常愈合仍然是一个值得深入探讨的课题。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓中一种具有多种分化潜能的细胞群。当骨折发生时,BMSCs向骨折部位聚集并分化成成骨细胞,是骨折愈合过程中成骨细胞的重要来源之一。干扰BMSCs的归巢会严重阻碍骨折愈合,但是尼古丁是否可能干扰BMSCs向骨折部位的归巢以及作用机制尚不清楚。白介素22（IL-22）是IL-10细胞因子亚家族的成员,在糜烂性关节炎、强直性脊柱关节病、骨化纤维发育不良等异位骨形成中高表达,并起重要作用,抑制或中和IL-22可减缓疾病进程。这些研究表明IL-22可能在骨形成和重建中发挥重要作用,骨形成和骨重建是骨折愈合的关键,然而缺乏尼古丁对IL-22影响的相关研究。本课题拟研究通过三个实验研究以下问题:尼古丁对BMSCs增殖、分化、迁徙能力的影响;探索尼古丁影响骨折部位募集BMSCs能力的作用机制;研究IL-22在骨骼中的表达,尼古丁对IL-22表达以及成骨破骨相互作用的影响。实验一尼古丁对BMSCs体外增殖、分化、迁移的影响目的:探索尼古丁对BMSCs体外增殖、分化、迁移能力的影响。方法:使用不同浓度尼古丁对BMSCs进行刺激,使用CCK-8法测量检测细胞增殖情况。使用含不同浓度尼古丁的成骨诱导培养基培养BMSCs21天,用茜素红染色来半定量检测矿化结节生成量,以评价尼古丁对BMSCs成骨向分化的影响。使用划痕实验和Transwell小室迁移试验来检测尼古丁对BMSCs迁移能力的影响。结果:尼古丁在低浓度时不影响BMSCs增殖,在1mM浓度时具有促进作用,在10mM时强烈抑制BMSCs增殖并导致细胞死亡。尼古丁在低浓度时不影响BMSCs的成骨向分化能力,在高浓度（1mM）时抑制成骨。在1μM-1mM浓度时尼古丁抑制BMSCs的迁移能力,并且与浓度呈正相关关系。结论:尼古丁在体外实验中对增殖能力存在双峰效应,在低浓度时不影响BMSCs增殖和BMSCs的成骨向分化能力,在高浓度时抑制成骨并可导致细胞死亡。尼古丁显著抑制BMSCs的迁移能力,并且与浓度呈正相关关系。实验二尼古丁影响BMSCs的募集及其作用机制目的:探索BMSCs向骨折部位归巢的生理机制;尼古丁对BMSCs迁徙能力影响的分子机制;尼古丁对成骨细胞分泌趋化因子能力的影响。方法:分别使用活骨片和灭活骨片与BMSCs细胞共培养,观察成骨细胞对BMSCs的募集作用,并加入尼古丁观察尼古丁对该作用的影响。使用不同浓度尼古丁刺激MC3T3-E1细胞和BMSCs,检测MC3T3-E1细胞中SDF-1,BMSCs中CXCR4,CXCR7,MMP-8,MMP-13的mRNA表达水平,和MC3T3-E1细胞中POSTN和Collagen I蛋白表达。使用专用内固定不锈钢板钉构建小鼠股骨骨折模型,皮下注射尼古丁观察2周、5周后取标本,用MicroCT分析各组愈合状态;构建单侧小鼠股骨骨折模型,健侧股骨骨髓腔内移植GFP小鼠来源的BMSCs,1周后使用小动物活体成像观察BMSCs向骨折部位归巢的情况,观察组织切片免疫荧光染色观察BMSCs在骨折区域聚集的状况。结果:包含着活成骨细胞的骨碎片具备吸引BMSCs迁徙的能力,尼古丁在体外抑制BMSCs向骨折片聚集。尼古丁抑制成骨细胞分泌SDF-1和POSTN,并抑制BMSCs中趋化因子受体CXCR4,CXCR7的表达,MMP-8,MMP-13表达无明显改变。在骨折模型建立2周及5周后Micro-CT三维重建图像显示,术后2周对照组愈合明显优于尼古丁组。Micro-CT的定量数据显示对照组新生骨量显著高于尼古丁刺激组（P<0.05）。7天的小动物活体成像和免疫荧光染色结果提示,尼古丁组小鼠骨折断端募集的EGFP+BMSCs显著降低。结论:尼古丁通过体外抑制成骨细胞分泌重要的趋化因子SDF-1和细胞外基质POSTN,并抑制BMSCs趋化因子受体CXCR4,CXCR7的表达从而抑制成骨细胞对BMSCs的募集。尼古丁可导致小鼠股骨骨折愈合延迟,抑制骨折区域募集BMSCs。实验三尼古丁促进成骨细胞分泌IL-22调控成骨破骨细胞相互作用。目的:探索IL-22在成骨细胞中表达情况;IL-22在成骨破骨相互作用中的作用和机制;尼古丁对IL-22表达的影响。方法:使用免疫荧光、免疫组化染色、免疫荧光双标确定骨小梁中IL-22的表达部位,用成骨诱导培养基培养MC3T3-E1细胞13天,提取mRNA和蛋白检测ALP、IL-22、IL-22BP表达水平;使用检测尼古丁刺激成骨细胞后IL-22表达变化,建立成骨破骨共培养体系,通过中和体系内的IL-22以及给与尼古丁刺激检测IL-22及尼古丁在成骨破骨相互作用中的功能。结果:免疫荧光和免疫组化结果显示在骨骺板和软骨下骨部位发现大量IL-22+细胞,免疫荧光双标显示在骨小梁表面存在大量ALP和IL-22双阳性细胞。Real-time PCR结果显示MC3T3-E1细胞中表达IL-22并随着成骨诱导时间增加ALP,IL-22表达上升,Western blot检测发现随着成骨诱导时间增加IL-22分泌增加并且IL-22BP分泌减少。尼古丁促进成骨细胞分泌IL-22。在成骨破骨共培养体系中,尼古丁促进破骨细胞形成,中和共培养体系中的IL-22可显著减少空白对照组及尼古丁刺激下生成的破骨细胞数量。结论:随着前成骨细胞分化成熟,IL-22表达增加。在成骨破骨相互作用中,IL-22促进破骨细胞形成。尼古丁促进成骨细胞分泌IL-22,促进成骨破骨共培养体系中破骨细胞形成。综上所述,低浓度尼古丁在不影响BMSCs增殖和成骨能力的同时抑制BMSCs趋化和迁徙能力,降低成骨细胞对BMSCs的募集能力从而抑制体内BMSCs从远端向骨折部位归巢能力,引起愈合延迟。本研究在成骨细胞中发现了IL-22的分泌,并发现IL-22参与成骨破骨细胞相互作用,尼古丁促进成骨细胞分泌IL-22,破坏成骨破骨平衡,可能是尼古丁影响骨折愈合的另一个重要因素。