口腔颌面部恶性肿瘤是目前人类常见恶性肿瘤之一,口腔癌位居全身恶性肿瘤的第六位。因此近年来虽然头颈部恶性肿瘤的治疗在一定程度上提高了患者的生活质量,但并没有延长患者的长期生存率。而患者的死亡主要是由于肿瘤复发、颈部淋巴结转移或远处脏器转移引起的,因此肿瘤的形成及转移的机制成为研究重点。化学药物作为中晚期病例手术前后的辅助治疗,可有效缓解肿瘤的生长,其也适用于有远处转移的病人。但是,部分患者在接受治疗后仍有肿瘤的复发甚至转移。目前,尚无文献研究比较经化疗后的剩余细胞与未经化疗的细胞两者的肿瘤复发和迁移的能力。为此,本次实验目的:探讨舌鳞癌细胞SCC-15经化疗药物作用前后的Nanog表达和迁移能力是否有改变。本文应用化疗药物作用舌鳞癌细胞系SCC-15,并检测顺铂作用前后与细胞增殖密切相关的Nanog基因的表达、细胞凋亡率及迁移能力的变化,试以探究经顺铂作用前后舌鳞癌细胞的细胞迁移和增殖能力的变化。实验中化疗药物以及基因的选择理由如下:1.顺铂(顺氯氨铂,cisplatin,DDP)属周期非特异性药物,为治疗多种实体瘤的一线用药。20世纪80年代,顺铂开始应用于头颈部癌症化疗,对头颈部鳞癌具有十分显著的疗效,其化疗效果优于多西他赛(docetaxe),且毒副作用较小,广泛用于舌鳞癌临床一线用药。2.nanog已被广泛认为参与调控胚胎干细胞的自我更新,在肿瘤细胞中,nanog的异常表达与体外细胞增殖能力的增强及体内肿瘤的生长有关,其积极调节肿瘤细胞活性和肿瘤转移能力。它是维持肿瘤细胞干性的关键性基因,促进几种癌症中的肿瘤干细胞样特征。例如,异位nanogp8基因的超表达能增强前列腺癌细胞克隆生长和肿瘤再生能力。并且胚胎nanog基因的激活能驱动结直肠癌细胞的一个亚群拥有一个干性样的表型。乳腺癌细胞系中nanog的过表达也能增强其化疗抗性,nanog蛋白质可以与周期蛋白d1的启动子区域结合,从而调节细胞周期和增殖。本文分为两个部分进行相关研究:第一部分舌鳞癌细胞系scc-15与正常细胞系293中nanog表达情况及半效抑制浓度ic50的测定目的:确定scc-15细胞系中是否有nanog表达,以及与人正常组织细胞系相比,人舌鳞癌细胞系中的nanog表达是否不同,应用细胞免疫荧光技术定性检测两细胞系中nanog表达情况。方法:首先应用细胞免疫荧光方法检测人舌鳞癌细胞scc-15细胞系中是否有nanog蛋白表达,并且同时比较与293细胞系中nanog表达情况进行比较。如scc-15细胞系中检测到有nanog表达,则可以进行后续实验。cck-8试剂盒的细胞毒性实验用于检测scc-15不同顺铂作用时间下的药物毒性半效抑制率(ic50),从而确定各试验组的实验条件。结果:(1)、在舌鳞癌细胞系中有nanog表达,而在正常成熟分化的293细胞中无表达,scc-15可应用于本实验中nanog基因的相关研究。(2)、成功通过细胞毒性实验结果得出各实验组的药物毒性半效抑制率,24h组的ic50约为5μg/ml,48h组为4μg/ml,72h组为3.5μg/ml,从而确定各实验组的实验条件(见表1.1)。第二部分顺铂作用前后细胞凋亡、nanog表达和迁移能力的对比研究目的:应用各种实验技术检测顺铂作用前后细胞凋亡情况的变化,以及nanog的mrna及蛋白表达情况是否改变,迁移能力的变化等。方法:为比较顺铂作用前后scc-15的细胞凋亡情况,我们应用annexin-fitc/pi双染色法结合流式细胞仪检测未用顺铂处理的scc-15即对照组以及经不同浓度顺铂分别处理24h、48h及72h的实验组,并计算细胞凋亡率;检测与肿瘤细胞增殖能力密切相关的nanog基因的mrna及蛋白表达水平,应用qrt-pcr及westernblot对各组细胞进行定量分析研究;划痕实验检测两组细胞迁移能力的变化。结果:细胞凋亡实验示:各组凋亡率结果如下:24h组(13.34±4.14)%、48h组(24.75±1.48)%、72h组(25.92±1.78)%,对照组(6.61±0.64)%。两两比较统计学差异分析,24h、48h及72h组分别与对照组相比p值分别为0.035,0.000及0.000,有统计学差异。各实验组分别与对照组比较,细胞凋亡率均高于对照组,可见顺铂促进细胞凋亡;qrt-pcr结果显示:从mrna水平上看,顺铂作用24h、48h及72h后nanog的mrna相对表达逐渐升高,表达量分别为(3.86±1.26)、(5.11±1.35)及(7.92±0.80),与对照组(1.04±0.36)相比均有增高(p=0.040;p=0.006;p=0.000),实验组nanog的mrna相对表达量均比对照组高。此外Western结果示,实验组24h,48h,72h蛋白表达量依次为:0.057±0.013,0.131±0.031,0.168±0.019,分别与对照组0.038±0.005两两比较(p=0.541;p=0.001;p=0.000)。除24 h组的表达量与对照组无差异外,其余两组的Nanog蛋白表达量均高于对照组。qRT-PCR及Western结果说明,通过顺铂作用于细胞,可以增强Nanog表达量。划痕实验显示:按v=s/t计算得出各组细胞移动速率:24h组(15.45±2.46)μm/h、48h组(35.74±2.19)μm/h、72h组(45.70±4.51)μm/h,分别与对照组(11.42±1.69)μm/h相比p=0.388;p=0.000;p=0.000。可见经顺铂作用时间越长的实验组,细胞迁移能力越强。结论:经化疗后的残存细胞的肿瘤形成能力和迁移能力都较未行化疗前的细胞增强。