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小拟南芥(Olimarabidopsis pumila)属十字花科无苞芥属(Olimarbidopsis),现在接受名为无苞芥,其花为黄色,果实被毛,其与模式植物拟南芥的亲缘关系较近,但比拟南芥具有更强的耐盐能力,广泛分布在新疆半干旱和半盐碱化的土地上。 目的:为了从小拟南芥中挖掘耐盐碱相关基因,采用5′帽子抗体富集全长cDNA、并利用Gateway技术构建了小拟南芥经500 mmol/L NaCl盐胁迫诱导的叶片均一化全长cDNA文库,从而避免了基因被内切酶切断的风险。并对文库中克隆进行随机测序分析。本研究为耐盐碱相关基因的挖掘、开展比较基因组学和基因组进化研究提供重要资源。 方法:利用Gateway技术及基因组饱和杂交技术构建了小拟南芥经500 mmol/L NaCl盐胁迫诱导叶片的均一化全长初始和均一化cDNA文库。从均一化文库中随机挑选1151个克隆进行测序,对测序所获得的EST进行分析,包括去除载体序列和低质量序列,序列拼接和装配, BLAST比对分析,功能注释和分类,以及信号通路分析。利用半定量RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)及实时荧光定量PCR(quantitative Real-time RT-PCR, qRT-PCR)技术分析contigs分别在高盐胁迫下的表达水平。利用RT-PCR方法和5′-RACE技术,克隆了一个 Na+/H+逆向转运蛋白基因 OpNHX1,构建植物表达载体及酵母表达载体,分别采用花滴法和乙酸锂转化法转化拟南芥和酵母突变体,分析转基因拟南芥的耐盐性以及对该基因进行功能验证。利用RT-PCR方法克隆一个类钙调素蛋白基因OpCML13并利用RT-PCR方法进行基因表达分析。 结果: (1)经检测初始文库、均一化文库的滴度分别1.6×106 cfu/mL和6.7×106 cfu/mL,重组率约为95％,插入片段平均大小大于1 kb。 (2)通过序列分析,共获得894条高质量表达序列标签(ESTs),装配成736个unigenes,包括72个contigs和664个singletons。比较分析表明736个唯一基因同拟南芥(Arabidopsis thanliana)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)和盐芥(Thellungiella salsuginea)有较高的相似性。根据基因本体论GO(Gene Ontology)将736个unigenes进行功能分类,涉及到广泛的生物学过程。分析与逆境相关的 ESTs,发现了小拟南芥中存在更多的逆境胁迫相关基因。将894条ESTs全部提交到GenBank中(登录号:JZ151519~JZ152412)。 (3)对均一化文库中丰度较高的16个contigs进行表达分析,以不同浓度NaCl处理24 h的小拟南芥叶片为材料,进行 RT-PCR,结果表明:contig10、11、14的表达量随着 NaCl浓度升高而逐渐升高;用200 mmol/L NaCl处理不同时间后的小拟南芥叶片为材料,进行RT-PCR,结果表明:contig7、9、11、16的表达量随着时间的增加而逐渐升高;用100μmol/L ABA胁迫不同时间的小拟南芥叶片为材料,进行qRT-PCR,结果表明:contig1、5、9、15、16的表达量随着时间的增加而逐渐升高。 (4)小拟南芥OpNHX1全长共2153 bp,最大开放阅读框(ORF)为1605 bp,编码534个氨基酸。系统进化树分析表明 OpNHX1编码产物与拟南芥、小盐芥亲缘关系较近,属于同一进化分支。OpNHX1基因在拟南芥的根、茎、叶、花和果荚中均有表达,其中在茎中表达量最高。并且高盐、干旱、低温和ABA等胁迫均能诱导OpNHX1基因的上调表达。将该基因在拟南芥中过量表达,显著提高了转基因植株在盐胁迫下的存活率。酵母功能互补实验结果显示该基因转化酵母Δnhx1后可以补充NHX1的缺失。 (5)小拟南芥OpCML13基因最大开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。OpCML13蛋白具有4个 EF-hands家族结构域,是一个亲水蛋白。系统进化树分析表明,OpCML13编码产物与拟南芥AtCML13和AtCML14进化关系较近,属于同一进化分支。氨基酸同源建模结果表明,此蛋白有8个α螺旋结构、2个β-折叠结构、10个β-转角。半定量RT-PCR结果显示,OpCML13基因在小拟南芥的不同组织中均有表达,在根中表达量较高且可以响应高盐、低温、干旱和ABA胁迫。 结论: 构建了高质量的小拟南芥初始和均一化全长cDNA文库,共获得894条高质量ESTs,装配成736个unigenes,包括72个contigs和664个singletons。初步对均一化文库中丰度较高的16个contigs进行表达分析,发现文库中存在大量响应盐胁迫的基因。克隆了小拟南芥OpNHX1和 OpCML13基因,转基因研究表明 OpNHX1基因可以增强植物的耐盐能力。OpCML13基因响应高盐、低温、干旱和 ABA胁迫,该基因在小拟南芥逆境胁迫中可能起着重要作用。