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本课题采用Smart Race-PCR技术及巢氏PCR技术从淡水贝类池蝶蚌中克隆到两个与性别决定相关的基因feminization-1基因的b、c两个亚型（Hsfem-1b、Hsfem-1c）的cDNA全长序列。Hsfem-1b基因的cDNA序列全长为2072bp，其中5’ UTR（非编码区）长度为50bp，3’ UTR长度为114bp，具有28bp长的polyA尾及加尾信号ATTAAA；开放阅读框(ORF)长度为1908bp，编码635个氨基酸组成的蛋白质；无信号肽，预测其分子量约为71.54kDa，理论等电点为6.05kD；HsFem-1b蛋白氨基酸序列C端存在一段高度保守序列：Pro-X-X-Leu-X-X-Phe-X-X-X-His（X为随机氨基酸）；SMART蛋白检测发现Hsfem-1b基因编码蛋白的功能域包含8个ANK(Ankyrin repeat motif)锚蛋白重复序列，并且运用SWISS-MODEL Workspace预测HsFem-1b蛋白的三维结构，与SMART预测结果一致，能清楚的看到8个ANK模体。Hsfem-1c基因的cDNA序列全长为2328bp，其中5’ UTR（非编码区）长度为137bp，3’ UTR长度为322bp，具有polyA尾及加尾信号AATAAA；开放阅读框（ORF）长度为1869bp，编码622个氨基酸组成的蛋白质；无信号肽，预测其分子量约为69.95kDa，理论等电点为7.05kD；HsFem-1c蛋白氨基酸序列C端同样也存在一段高度保守序列：Pro-X-X-Leu-X-X-Phe-X-X-X-His（X为随机氨基酸）；SMART蛋白检测发现Hsfem-1c基因编码蛋白的功能域包含9个ANK（Ankyrin repeat motif）锚蛋白重复序列，并且运用SWISS-MODELWorkspace预测HsFem-1c蛋白的三维结构，与SMART预测结果一致，能清楚的看到9个ANK模体。利用Q-PCR技术检测池蝶蚌不同组织Hsfem-1b和Hsfem-1c基因的mRNA表达情况。结果表明：Hsfem-1b和Hsfem-1c基因的mRNA表达均存在明显的组织差异性。Hsfem-1b和Hsfem-1c基因都是在精巢组织中表达量最高，分别是肾脏的72.35倍、77.87倍。在肝胰腺、肠、卵巢中的表达量次之，在血淋巴、外套膜、鳃和闭壳肌中的表达量较低，肾脏中表达量最低。分析不同年龄层次池蝶蚌精巢中Hsfem-1b和Hsfem-1c的mRNA表达，发现Hsfem-1b和Hsfem-1c基因随着精巢的发育，它们的表达水平变化趋势也不一样。随着性腺的成熟和精子的发生，Hsfem-1b基因的表达逐渐增强，说明它在池蝶蚌精子的发生或性腺发育的过程中具有重要的作用。Hsfem-1c基因在2龄池蝶蚌精巢中的表达量显著提高，是1龄的6.77倍；然而，在3~4龄时表达水平反而回落，至5龄时，表达水平又显著上升至1龄的7.67倍，与2龄表达水平相平。池蝶蚌在2龄时性腺细胞向精原细胞或卵原细胞方向发育，说明Hsfem-1c基因可能参与池蝶蚌性腺细胞雄性性别分化的过程，并且可能与精子的发生有关。通过双酶切连接，构建pET32-HsFem-1b和pET32-HsFem-1c原核表达载体，将测序正确的重组原核表达质粒转化至Ecoi.li(DE3)，IPTG诱导成功表达了两种融合蛋白。HsFem-1b重组蛋白以包涵体的形式存在，通过变性剂尿素溶解包涵体，梯度稀释法复性后根据Ni2+螯和层析法原理纯化出单一的目的蛋白。HsFem-1c蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，直接通过镍柱纯化获得单一的目的蛋白。利用纯化的重组HsFem-1c蛋白制备兔多抗隆抗体，Elisa测出其血清抗体效价在512000以上，说明获得了较高效价的兔抗体血清。经Western blotting检测发现重组HsFem-1c蛋白可以与兔抗体血清特异性地结合。根据荧光抗体原理，通过制作冰冻切片，并利用获得的兔多抗血清在性腺细胞中定位HsFem-1c蛋白的表达情况，发现HsFem-1c蛋白主要在细胞内表达。