阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是最常见的痴呆类型，目前全球大约有5000多万AD患者，平均每3秒会增加一例。AD作为难以治愈的疾病，严重危害着中老年人的健康。β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积形成的老年斑(senile plaque，SP)和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)是AD主要的病理特征。根据发病年龄特点，AD分为早发型(early onset Alzheimers disease，EOAD)（年龄＜65岁）和晚发型阿尔茨海默病(late onset Alzheimers disease，LOAD)（年龄≥65岁）两种类型。EOAD多为早老素1(presenilin1，PSEN1)基因、早老素2基因及淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)基因突变所致。PSEN1基因突变是EOAD患者最常见的致病基因，当其突变时使得蛋白活性下降，导致Aβ沉积，现已经发现其200余种突变。2013年我们的研究团队在一个汉族EOAD家系中发现了PSEN1p.G378E突变，先证者39岁死亡，尸检行病理检查可见EOAD特征性的改变:大脑皮层内广泛神经元死亡、星形胶质细胞激活、Aβ42沉积及NFTs形成。虽然全世界对AD的研究投入了很大的财力物力，但其发病机制尚不完全明确，AD的治疗仍为很大的难题，引发了人们对AD的发病机制的探讨。现在越来越多的证据证明慢性炎症反应在AD的病理中起重要作用，其可以直接或间接影响tau蛋白磷酸化。研究者在LOAD患者的脑组织中发现，酪氨酸激酶结合蛋白(Tyrosine kinase binding protein，TYROBP)基因表达上调，其编码的TYROBP蛋白在脑内主要表达在小胶质细胞，当其与相应受体结合时，可通过多种信号通路来介导炎症反应、细胞凋亡等。在AD转基因小鼠的脑组织中，TYROBP蛋白的mRNA含量增加。TYROBP蛋白在AD病理中发挥什么样的作用？TYROBP蛋白是否参与PSEN1p.G378E所致的AD患者脑组织的炎症反应，从而影响AD病理（tau蛋白磷酸化）的改变？这些问题值得探讨。本实验通过研究TYROBP基因对PSEN1p.G378E突变所致的AD小鼠tau蛋白磷酸化的影响，探讨TYROBP蛋白对AD病理的影响，为AD的治疗提供一种新思路。　　研究目的：　　完成TYROBP基因敲除小鼠及PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠的构建，并对其杂合型纯化繁殖杂交，得到野生型(WT)、TYROBP基因敲除杂合型（TYROBP-/+）和TYROBP基因敲除纯合型（TYROBP-/-）、PSEN1p.G378E敲入杂合型（PSEN1G378E/WT）和PSEN1p.G378E敲入纯合型（PSEN1G378E/G378E）、杂交小鼠杂合型（TYROBP-/+;PSEN1G378E/WT）和杂交小鼠纯合型（TYROBP-/-;PSEN1G378E/G378E）这7种不同基因型的小鼠。对不同基因型小鼠的行为学改变、AD病理改变及炎症细胞、炎症因子的表达水平进行分析，探讨TYROBP基因对PSEN1p.G378E突变所致的AD小鼠tau蛋白磷酸化的影响，探讨TYROBP蛋白在AD的发生发展中的作用，进一步了解AD的发病机制，为AD治疗提供一种新思路。　　研究方法：　　本实验委托赛业生物科技公司进行了2月龄TYROBP基因敲除杂合型小鼠（TYROBP-/+）及PSEN1p.G378E敲入杂合型AD小鼠(PSEN1G378E/WT)的构建。对其杂合型小鼠分别进行纯化、繁殖，利用基因检测的方法分别鉴定出野生型(WT)、TYROBP基因敲除杂合型（TYROBP-/+）、TYROBP基因敲除纯合型（TYROBP-/-）、PSEN1p.G378E敲入杂合型（PSEN1G378E/WT）、PSEN1p.G378E敲入纯合型（PSEN1G378E/G378E）小鼠，将TYROBP基因敲除纯合型（TYROBP-/-）和PSEN1p.G378E敲入纯合型（PSEN1G378E/G378E）小鼠再杂交，得到杂交小鼠杂合型（TYROBP-/+;PSEN1G378E/WT）和杂交小鼠纯合型（TYROBP-/-;PSEN1G378E/G378E）。本实验以5月龄的7种不同基因型小鼠为研究对象，应用水迷宫实验检测不同基因型小鼠的行为学改变，采用ANY-maze软件记录小鼠的游泳轨迹;应用蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测不同基因型小鼠海马组织中磷酸化tau蛋白及磷酸化信号通路蛋白的表达水平;应用免疫荧光技术观察小鼠海马组织中TYROBP蛋白表达的位置及炎症细胞（小胶质细胞、星形胶质细胞）的形态改变;应用酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验测定不同基因型小鼠海马组织中炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的表达水平。本实验数据采用SPSS20.0统计软件进行分析，实验中涉及的计量资料数据以(x)±s表示，多个样本均数比较时，首先对其进行方差齐性检验，然后采用单因素方差分析(one-way ANOVA)（方差齐）和Kruskal-Wallis H检验（方差不齐）方法进行数据处理。对于水迷宫实验中涉及的重复测量数据，采用重复测量数据的方差分析进行统计分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。　　研究结果：　　1、本研究成功构建了TYROBP基因敲除杂合型小鼠及PSEN1p.G378E敲入杂合型AD小鼠，并得到了野生型(WT)、TYROBP基因敲除杂合型（TYROBP-/+）和TYROBP基因敲除纯合型（TYROBP-/-）、PSEN1p.G378E敲入杂合型（PSEN1G378WT）和PSEN1p.G378E敲入纯合型（PSEN1G378E/G378E）、杂交小鼠杂合型（TYROBP-/+;PSEN1G378E/WT）和杂交小鼠纯合型(TYROBP-/-;PSEN1G378E/G378E)这7种不同基因型的小鼠。　　2、水迷宫实验结果:(1)在定位航行训练实验中，每种基因型小鼠逃避潜伏期随训练天数的增加而减少(P＜0.05)，与WT小鼠相比，PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠的逃避潜伏期相对较长。在第5天，TYROBP基因敲除小鼠纯合型（TYROBP-/-）及杂交小鼠纯合型（TYROBP-/-;PSEN1G378E/G378E）的逃避潜伏期均低于PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠。(2)PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠寻找平台的搜索策略主要是“随机式”，符合AD小鼠的游泳策略的异常变化。其他基因型小鼠主要是从“边缘式”或“随机式”向“趋向式”改变。(3)在空间探索实验中，与WT小鼠相比，PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠的穿台次数及目标象限游泳时间百分比均明显下降(P＜0.05)，而TYROBP基因敲除小鼠与WT小鼠之间无明显差异(P＞0.05)。　　3、免疫荧光结果显示，TYROBP蛋白主要在小胶质细胞中表达，Western blot结果显示，TYROBP蛋白在PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠的海马组织中表达增加，在TYROBP基因敲除小鼠及杂交小鼠中的表达下降。　　4、总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的表达水平:在TYROBP基因敲除小鼠中，总tau蛋白、AT8、T181的表达水平高于WT小鼠(P＜0.05)，PHF1和T231蛋白表达无改变(P＞0.05)。在PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠模型中，总tau蛋白、AT8、T181、T231、PHF1蛋白的表达水平均高于其他基因型小鼠(P＜0.05)。在杂交小鼠中，特别是杂交小鼠纯合型（TYROBP-/-;PSEN1G378E/G378E）的总tau蛋白和磷酸化tau蛋白（AT8、T181和T231）的表达水平低于TYROBP基因敲除小鼠及PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠。　　5、磷酸化信号通路蛋白的表达情况:(1)CDK5和P-CDK5蛋白的表达水平:PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠和TYROBP基因敲除小鼠＞杂交小鼠纯合型＞WT小鼠(P＜0.01)，而PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠和TYROBP基因敲除小鼠之间无明显差异(P＞0.05)。(2)ERK和P-ERK蛋白的表达水平:杂交小鼠纯合型(TYROBP-/-;PSEN1G378E/G378E)的ERK蛋白表达水平均低于其他基因型小鼠(P＜0.01)，TYROBP基因敲除小鼠的P-ERK蛋白的表达水平高于WT小鼠，其他基因型小鼠之间的ERK蛋白和P-ERK蛋白的表达无明显差异(P＞0.05)。(3)GSK3β和P-GSK3β蛋白的表达水平:PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠＞TYROBP基因敲除小鼠＞杂交小鼠＞WT小鼠(P＜0.01)。　　6、炎症细胞的表达情况:TYROBP基因敲除小鼠和PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠＞WT小鼠(P＜0.05)，且杂交小鼠低于PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠。　　7、炎症因子的表达情况:PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠的IL-6表达水平高于其他基因型小鼠(P＜0.05);杂交小鼠海马组织中IL-1β的表达低于PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠纯合型（PSEN1G378E/G378E）(P＜0.05);各基因型小鼠海马组织的TNF-α的表达无明显统计学意义(P＞0.05)。　　研究结论：　　1、本研究成功构建了TYROBP基因敲除小鼠及PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠，并得到了野生型(WT)、TYROBP基因敲除杂合型(TYROBP-/+)和TYROBP基因敲除纯合型（TYROBP4-/-）、PSEN1p.G378E敲入杂合型（PSEN1G378E/WT）和PSEN1p.G378E敲入纯合型（PSEN1G378E/G378E）、杂交小鼠杂合型（TYROBP-/+;PSEN1G378E/WT）和杂交小鼠纯合型（TYROBP-/-;PSEN1G378E/G378E）这7种不同基因型的小鼠。　　2、PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠是成功的AD小鼠模型。　　3、TYROBP蛋白在PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠的海马组织中表达增加，其主要表达在小胶质细胞。　　4、在PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠模型中，主要通过GSK3β和CDK5信号通路来介导tau蛋白磷酸化(AT8、T181、T231、PHF1)，且TYROBP基因缺陷可在一定程度上减少AD的tau蛋白磷酸化水平。　　5、炎症反应参与AD的病理变化，TYROBP基因缺陷可通过减少小胶质细胞和星形胶质细胞的数量、降低炎症因子IL-6的表达对其有所改善。　　6、TYROBP基因缺陷可以在一定程度上提高AD小鼠的空间学习能力，而对空间记忆能力无明显改善。