论文部分内容阅读
目的：研究蛋白酶活化受体1(protein activated receptor 1)PAR1在热打击引起血管内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVECs)炎症激活中的作用,阐明PAR1在重症中暑小鼠全身炎症反应中的作用。方法：1.构建体外HUVECs热打击模型,采用RT-PCR及ELISA方法分别检测42℃热打击HUVECs 2 h后不同时间段TNF-α、IL-6、ICAM-1的mRNA和蛋白表达水平；2.采用荧光显微镜观察单核细胞对热打击HUVECs后粘附的影响；3.采用western blot及RT-PCR方法分别检测热打击HUVECs后不同时间段PAR1蛋白及mRNA的表达水平；4.采用PAR1 siRNA及腺病毒过表达预处理HUVECs,检测37℃及42℃热打击后8h PAR1的表达;5.采用RT-PCR检测PAR1抑制剂、激动剂、siRNA、PAR1腺病毒过表达对热打击HUVECs 8 h后TNF-α、IL-6、ICAM-1的mRNA表达水平的影响；6.采用ELISA检测PAR1抑制剂、激动剂、siRNA、PAR1腺病毒过表达对热打击HUVECs 8 h后细胞上清液中的TNF-α、IL-6、ICAM-1表达水平的影响；7.采用荧光显微镜观察PAR1抑制剂、激动剂、siRNA、PAR1腺病毒过表达对热打击HUVECs 8 h后对单核细胞粘附的影响；8.构建小鼠中暑模型,免疫组化检测心、肝、肺和小肠上PAR1蛋白的表达；9.采用ELISA检测正常小鼠及重症中暑、PAR1抑制剂、激动剂对重症中暑小鼠6h后血清中TNF-α、IL-6、ICAM-1的表达水平；10.采用H&E染色检测PAR1抑制剂、激动剂对重症中暑小鼠的脏器损伤的影响；11.观察PAR1抑制剂、激动剂对重症中暑小鼠的生存率的影响。结果：1.热打击使HUVECs TNF-α、IL-6、ICAM-1 mRNA表达增加(图1.1,表1.1)；2.热打击使HUVECs炎症因子TNF-α/IL-6和粘附因子ICAM-1蛋白分泌增加(表1.2);3.热打击使单核细胞对HUVECs粘附增加(图2,表2)；4.热打击使HUVECs的PAR1 mRNA和蛋白表达增加(图3,表3)；5.PAR1 siRNA能有效降低热打击后PAR1的表达/AdPAR1有效增加热打击后PAR1的表达(图4,表4)；6.抑制或敲低PAR1可降低细胞因子TNF-α／IL-6和粘附因子ICAM-1 mRNA表达,而激活或过表达则可增加上述基因(图5.1,5.2,表5.1,5.2)；7.抑制或敲低PAR1可降低细胞因子TNF-α/IL-6和粘附因子ICAM-1蛋白分泌,而激活或过表达则可增加上述蛋白分泌(表5.3,5.4)；8.抑制PAR1可减少单核细胞对HUVECs的粘附,而激活PAR1则增强这种粘附(图6.1,表6.1)；9.敲除PAR1可减少单核细胞对HUVECs的粘附,而PAR1过表达则增强这种粘附(图6.2,表6.2)；10.PAR1蛋白在重症中暑小鼠心、肝、肺和小肠表达增加(图7)；11.抑制PAR1可降低重症中暑小鼠血清TNF-α、IL-6和ICAM-1水平,而激活PAR1则增加上述蛋白水平(表7)；12.抑制PAR1可减轻重症中暑心、肝、肺、小肠损伤,而激活PAR1则加重上述脏器损伤(图8)；13.抑制PAR1可提高重症中暑小鼠72h存活率,而激活PAR1则降低72h存活率(图9,表8)；1.热打击可导致内皮细胞PAR1活化,进而导致血管内皮细胞炎症激活通路。2.PAR1参与了重症中暑小鼠全身炎症激活。