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目的:NS2TP基因是抑制性消减杂交技术(SSH)筛选出的HCV NS2反式激活的基因之一。本实验中,我们对HCV NS2反式激活NS2TP基因从翻译水平和转录水平进行验证,进而定位NS2TP基因启动子的核心区域,并初步探究了NS2TP基因的转录调节机制。方法:(1) HCV NS2对NS2TP基因反式激活作用的验证。首先,运用pcDNA3.1(–)-NS2表达载体转染HepG2细胞,以pcDNA3.1(–)为阴性对照组。提取总蛋白、总RNA,然后分别从翻译水平,即Western Blot实验,和转录水平,即进行Real-time PCR实验。分析和研究NS2对NS2TP基因的反式激活作用。(2) NS2TP基因启动子的活性分析与核心区的确定。首先,成功构建pGL4.10-NS2TP启动子双荧光素酶报告基因表达载体系统,运用构建的不同截短型载体转染HepG2细胞,在对启动子活性进行分析的基础上,实验确定了NS2TP基因启动子活性的核心区域,同时也分析了NS2对NS2TP基因启动子的调节作用。(3) NS2TP基因转录调节因子CREB作用启动子核心区的验证。运用生物信息学技术分析了启动子的核心区,识别CREB因子结合位点,并通过EMSA、ChIP、CREB位点突变、过表达CREB蛋白和特异性抑制CREB实验,研究转录调节因子CREB是否参与了NS2TP基因的转录调节。结果:(1) Real-time PCR实验证实,HCV NS2上调NS2TP基因的转录水平,Western Blot实验,证实HCV NS2促进NS2TP的表达。(2) NS2TP基因最小的启动子活性区域位于转录起始位点上游257个核苷酸(–257-bp至+93-bp)内,同时我们也验证了NS2上调NS2TP基因启动子的活性。(3)通过EMSA和ChIP,证实CREB为NS2TP基因主要转录因子调节蛋白。CREB位点突变、过表达CREB和特异性抑制CREB实验,证实CREB参与了NS2TP基因的调节。结论:(1) HCV NS2能够反式激活NS2TP基因。(2) NS2TP基因启动子的核心区位于–257-bp至+93-bp。(3) CREB转录调节因子参与NS2TP基因的转录调控。