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抗菌脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物,其种类繁多、结构复杂,具有许多特殊的生物活性.抗菌脂肽由于具有可生物降解、不会造成污染、无毒或低毒等优点,在工农业生产中已经得到了较为广泛的应用。然而,由于抗菌脂肽的发酵水平较低,导致成本太高,限制了抗菌脂肽的工业化生产和应用。因此,寻找能够提高抗菌脂肽产量、降低生产成本的途径已成为亟待解决的重要任务。本研究在实验室前期研究工作的基础上,对Bacillus amyloliquefaciensES-2-4在5L反应器中的发酵条件进行了优化,并对其发酵动力学进行了研究,同时初步探讨了在发酵过程中病原菌对抗菌脂肽产量的影响,旨在为抗菌脂肽的工业化生产提供理论依据。主要研究结果如下:
1.Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4在5L发酵罐中产抗菌脂肽发酵条件的优化。通过单因素试验确定发酵温度、接种量、通气量和搅拌转速为影响Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4抗菌脂肽产量的因素。采用四因素三水平正交试验法(L34)进一步对发酵条件进行优化。结果表明,四个因素对抗菌脂肽产量的影响大小依次为:A(温度)>C(通气量)>B(接种量)>D(搅拌转速);得到最佳条件为:温度30℃,接种量5%,通气量2.5 L/min,搅拌转速250 rpm。在此条件下抗菌脂肽产量达到512.8 mg/L。
2.Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4发酵过程动力学的研究。实验分别采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类似于Luedeking-Piret方程的公式来描述抗菌脂肽发酵过程中菌体生长情况、抗菌脂肽Surfactin的产出过程和基质葡萄糖的消耗情况,采用SAS统计软件根据试验值求取出各个方程和公式中的参数,并拟合出以下各个变量的变化过程。
(1)发酵菌株ES-2-4的菌体生长动力学方程为
X=0.4423e0.0915t/(1.9455+0.2056e0.0915t)
R2=0.9826,该方程对发酵过程中后期菌体浓度的拟合效果较为理想,对发酵前期菌体浓度的拟合效果较为一般。
(2)产物Surfactin合成动力学方程为
P=368.125*ln((1.9455+0.2056e0.09151)/2.1511)+375.4184434/(1.9455+0.2056e0.0915t)-151.3063
R2=0.868,该方程对Surfactin发酵生产过程的拟合效果较为一般,体现在发酵初期计算值与试验值之间的误差很大,但发酵中后期误差大大减小。
(3)基质葡萄糖消耗动力学方程为
S=43.0016-27.7302[X-0.2056]+2.5655ln[1-0.09558(1-e0.0915t)]
R2=0.9891,该方程对底物葡萄糖消耗过程的拟合效果较好,对生产实践具有一定的指导意义.
3.诱导菌对菌株ES-2-4产抗菌脂肽的影响。结果表明,发酵10 h后添加大肠杆菌培养液,当添加浓度较低时对Surfactin诱导效果最好,在添加量为12.5ml/L时,Surfactin浓度最高,为681.1 mg/L,比对照组提高27.1%;对Fengycin而言,大肠杆菌培养液的诱导作用更明显,当添加量为12.5 ml/L时,Fengycin浓度为1432mg/L,添加量为37.5 ml/L时,Fengycin浓度为1532 mg/L,分别提高44.6%和54.7%。发酵20 h后添加活性病源菌,也是浓度较低时Surfactin产量高,当添加浓度为12.5 ml/L时,Surfactin浓度最高,达到733.1 mg/L,较对照组提高34.5%; Fengycin浓度变化规律与Surfactin一致,也是在诱导菌浓度为12.5 ml/L时浓度达到最高,为1777 mg/L,提高39.6%。发酵10 h添加灭活的大肠杆菌,发现诱导效果远没有活菌的诱导效果好。其中,Surfactin浓度以灭活菌添加量为0.5 ml/L时最高,为605.9 mg/L,仅比对照组增加7.4%,其余各组浓度均低于对照;Fengycin浓度以灭活菌添加量为0.5和1.5 ml/L时最高,分别达到2124和2109 mg/L,比对照增加13.9%和13.1%,其余各组也低于对照。而发酵10 h添加灭活米曲霉诱导,发酵液中抗菌脂肽不论是Surfactin还是Fengycin,产量均下降.