鼻咽癌高发于我国南方，目前主要治疗方法包括：放疗、化疗、手术，但局部复发和远处转移是治疗失败的主要原因，化疗是最主要的辅助治疗手段，然而肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性（MDR）使鼻咽癌的治疗变得更加困难，需要探索直接针对多药耐药肿瘤细胞的新技术。光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）是一种新兴的肿瘤治疗方法，利用肿瘤组织选择性摄入特定的化学物质，在一定波长的光作用下产生光动力效应而达到破坏肿瘤组织的目的。因为光敏剂优先积聚在肿瘤部位，有可能杀伤多药耐药的肿瘤细胞，光动力对于多药耐药肿瘤是一种可供选择的治疗手段。PDT的核心是光敏剂，目前临床上广泛应用的光敏剂是血卟啉衍生物（HPD），虽然在肿瘤的临床诊断和治疗中都取得了肯定的疗效，但仍有很多不足之处：作用光谱不理想；对组织的穿透能力较差；给药至光照的时间间隔长；用药前需皮试；价格昂贵；特别是皮肤光敏副作用较大，可持续到治疗后六周。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是目前光动力学疗法领域中最活跃的光敏剂前体物，它因能够有效地通过外源加入的方式，在肿瘤细胞中生成光敏剂原卟啉（PpⅨ）而在PDT领域独树一帜。由5-ALA引起的皮肤光致敏作用只需两天就可以消除，且价格便宜，能够口服用药，因此，5-ALA以局部或全身给药的方式被广泛用于治疗皮肤癌、食道癌等肿瘤。5-ALA-PDT用于鼻咽癌治疗起步较晚，本课题拟从四个方面进行相关研究，第一部分通过观察5-ALA-PDT对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2及其顺铂耐药株CNE2／DDP的生物作用，探讨光动力治疗鼻咽癌及多药耐药鼻咽癌的可行性。第二部分通过观察5-ALA-PDT对荷耐药、非耐药鼻咽癌裸鼠的肿瘤体内杀伤作用，为临床应用PDT治疗鼻咽癌提供理论支持和实验依据。第三、四部分探讨光动力杀伤耐药、非耐药鼻咽癌的机制及多药耐药调节剂维拉帕米是否对5-ALA-PDT杀伤耐药鼻咽癌具有增效作用，为鼻咽癌综合治疗提供参考。第一部分5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对人鼻咽癌耐药／非耐药细胞体外作用的实验研究目的：通过观察5-ALA-PDT对体外培养CNE2及CNE2／DDP细胞的生物作用，探讨光动力治疗鼻咽癌及多药耐药鼻咽癌的可行性，及最佳用药剂量、用药时间、最佳激光剂量等。1．方法：1．1 CNE2或CNE2／DDP细胞生物学特性检测：细胞形态学观察；流式细胞术分析CNE2或CNE2／DDP的细胞周期、检测P-gP、ABCG2表达及细胞荧光物质罗丹明排出；MTT法检测CNE2或CNE2／DDP细胞对顺铂、长春新碱、5氟尿嘧啶三种化疗药耐药指数。1．2共聚焦显微镜下观察PpⅨ在CNE2和CNE2／DDP细胞内定位。1．3流式细胞术或荧光分光光度计检测不同孵育时间、不同5-ALA浓度对CNE2或CNE2／DDP细胞内光敏剂PpⅨ的荧光强度的影响。1．4 MTT法测定不同5-ALA孵育时间及其介导PDT对CNE2或CNE2／DDP细胞细胞存活率的影响。1．5 MTT测法定不同5-ALA浓度及其介导PDT对CNE2或CNE2／DDP细胞细胞存活率的影响。1．6 MTT法测定不同激光能量PDT对CNE2或CNE2／DDP细胞存活率的影响。2．结果：2．1细胞生物学特性检测结果CNE2胞体较大，胞浆亮，在培养瓶中分布及生长均匀；CNE2／DDP胞体相对较小，圆形，在培养瓶中常常呈现分片聚集现象。CNE2／DDP的G₀／G₁期细胞较CNE2明显增多，而S期细胞显著减少；CNE2／DDP对DDP、5-Fu、VCR三种药物耐药指数分别为24.56、224.21和52.65；CNE2／DDP、CNE2细胞P-gP、ABCG2表达率分别为（75.84±1.14）％、（2.78±0.70）％和（54.96±1.20）％、（2.75±0.55）％；CNE2／DDP细胞内罗丹明荧光强度远低于CNE2细胞（2.98vs243.6）2．2共聚焦显微镜观察CNE2或CNE2／DDP细胞内PpⅨ主要弥散地分布在细胞的胞膜、胞浆中，而细胞核中少见分布。2．3 CNE2或CNE2／DDP胞内PpⅨ的荧光强度表现为对5-ALA共孵育时间、5-ALA浓度的量效依赖关系，但当孵育时间达6h、5-ALA浓度为0.5-1.00mmol／L时出现了饱和现象。在相同条件下，CNE2细胞胞内PpⅨ荧光强度均显著高于相应CNE2／DDP细胞。2．4 CNE2或CNE2／DDP细胞存活率与5-ALA和细胞的共孵育时间、5-ALA浓度、激光能量呈负相关，但当孵育时间为6小时、5-ALA浓度1.0或0.5mmol／L，激光剂量为40J／cm²时，CNE2或CNE2／DDP细胞存活率进入平台期，继续延长孵育时间，提高5-ALA浓度或增加激光剂量并不能显著降低CNE2或CNE2／DDP细胞存活率。相同条件下，CNE2细胞存活率明显低于CNE2／DDP细胞。5-ALA与CNE2或CNE2／DDP孵育6 h、激光剂量为40J／cm²条件下，5-ALA浓度为1.0mmol／L、0.5mmol／L时，5-ALA-PDT分别对CNE2和CNE2／DDP细胞产生充分的杀伤作用。单用不同浓度的5-ALA或单用不同剂量激光辐射对CNE2和CNE2／DDP细胞存活率无影响。3．结论：3．1两株细胞生物学特性显著不同，CNE2／DDP细胞具有耐药细胞特征，是研究耐药鼻咽癌的良好模型。3．2 5-ALA与CNE2和CNE2／DDP细胞共孵育产生PpⅨ，主要定位于胞浆、胞膜，胞核未见PpⅨ荧光。3．3 CNE2和CNE2／DDP胞内PpⅨ荧光强度随着5-ALA的浓度的增加而增加，但在1.00mmol／L时出现饱和，在孵育6 h达高峰。3．4 5-ALA-PDT对CNE2和CNE2／DDP细胞均具有杀伤作用：最佳孵育时间为6小时，最佳药物浓度为0.5-1.00mmol／L，最佳激光剂量为40J／cm²。5-ALA及激光本身对细胞无明显毒性作用。3．5在相同5-ALA浓度与激光剂量条件下，5-ALA-PDT对CNE2的杀伤作用大于CNE2／DDP，表明CNE2／DDP对5-ALA-PDT存在一定程度的交叉抵抗。第二部分5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对裸鼠人鼻咽癌移植瘤作用的研究目的探讨5-ALA-PDT对荷耐药、非耐药鼻咽癌裸鼠的移植瘤体内杀伤作用。1．方法：1．1以CNE2或CNE2／DDP细胞制备裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型。1．2 CNE2或CNE2／DDP细胞荷瘤裸鼠分别设5-ALA-PDT组、荷瘤对照组、激光对照组、5-ALA组。1．3分别于处理后第1、3、7、14、21天，测量四组的裸鼠肿瘤大小，计算肿瘤体积，末次测量后处死裸鼠，切除肿瘤称重并行病理组织学检查。2．结果：2．1以1×10⁷个CNE2和CNE2／DDP细胞接种裸鼠背部，可以成功复制出裸鼠人鼻咽癌移植瘤的模型。2．2 5-ALA-PDT对CNE2和CNE2／DDP细胞裸鼠移植瘤的作用：第3、7、14、21天，CNE2或CNE2／DDP细胞裸鼠移植瘤的5-ALA-PDT组肿瘤体积显著小于其他三组。5-ALA-PDT处理后第7、14、21天时，CNE2／DDP裸鼠肿瘤体积均显著大于CNE2裸鼠肿瘤体积。但荷瘤对照组、激光对照组、5-ALA组三组之间相互比较无显著性差异。CNE2或CNE2／DDP裸鼠的5-ALA-PDT组肿瘤重量明显低于各对照组，但三组对照组之间肿瘤重量无显著性差异。经5-ALA-PDT处理后，CNE2／DDP裸鼠肿瘤重量显著高于CNE2裸鼠。2．3病理检查显示：5-ALA-PDT组肿瘤组织大片坏死及退化、变性，血窦破坏。3．结论：5-ALA-PDT对CNE2和CNE2／DDP细胞裸鼠移植瘤均具有治疗作用，但对CNE2裸鼠移植瘤的杀伤作用强于CNE2／DDP裸鼠移植瘤；单纯给予5-ALA或单纯给予激光对CNE2和CNE2／DDP细胞裸鼠移植瘤没有明显的抑制作用。第三部分5-氨基乙酰丙酸介导的光动力对人鼻咽癌耐药／非耐药细胞作用的机制研究目的探讨5-ALA-PDT杀伤耐药、非耐药人鼻咽癌的作用机制。1．方法：1．1爬片法培养CNE2或CNE2／DDP人鼻咽癌细胞，随机分为空白对照组、单纯5-ALA组、单纯激光组、5-ALA-PDT组，使用Hoechst33258染色和、Annexin-V—PI染色检测凋亡。1．2收集CNE2或CNE2／DDP细胞分成空白对照组与5-ALA-PDT组，行Annexin-V—PI染色流式细胞术分析。1．3上述四组细胞行透射电镜观察。1．4荷瘤对照组、单纯激光组、单纯5-ALA组、5-ALA-PDT组裸鼠肿瘤组织行MDA含量测定。1．5上述四组裸鼠肿瘤组织行透射电镜观察。1．6上述四组裸鼠肿瘤组织使用TUNEL法检测组织细胞凋亡。1．7收集CNE2或CNE2／DDP细胞分成空白对照组与5-ALA-PDT组，采用流式细胞术分析两组细胞凋亡调节基因蛋白Bax与Bcl-2表达。2．结果：2．1 5-ALA-PDT对人鼻咽癌CNE2或CNE2／DDP细胞的作用（1）Hoechst33258凋亡染色法、Annexin-V—PI染色法均发现，CNE2或CNE2／DDP细胞只有5-ALA-PDT组有细胞凋亡现象，而空白对照组、单纯5-ALA组、单纯激光组细胞无凋亡细胞。Annexin-A—PI染色法同时发现坏死和凋亡细胞。（2）透射电镜观察发现，CNE2或CNE2／DDP细胞5-ALA-PDT组在存在大量坏死细胞的同时有部分凋亡细胞，而其它组细胞表现基本正常。（3）Annexin-V—PI染色法流式细胞术定量分析示：CNE2或CNE2／DDP细胞5-ALA-PDT组其细胞凋亡率、坏死率、凋亡+坏死率均显著高于空白对照组。CNE2细胞坏死率明显高于CNE2／DD细胞，而CNE2／DDP细胞凋亡率则显著高于CNE2细胞。2．2人鼻咽癌移植瘤裸鼠肿瘤组织检测（1）荷瘤裸鼠肿瘤组织MDA测定：CNE2与CNE2／DDP裸鼠的5-ALA-PDT组肿瘤组织MDA含量显著高于其他三组高。CNE2裸鼠5-ALA-PDT组肿瘤组织的MDA含量高于CNE2／DDP裸鼠。（2）肿瘤组织透射电镜观察：PDT组存在大量坏死细胞及部分凋亡细胞，而其他组肿瘤组织细胞表现基本正常。（3）TUNEL法检测裸鼠肿瘤组织细胞凋亡：CNE2或CNE2／DDP裸鼠5-ALA-PDT组的凋亡指数显著高于其他相应三组对照；CNE2／DDP裸鼠5-ALA-PDT组肿瘤凋亡指数高于CNE2裸鼠5-ALA-PDT组。2．3 CNE2和CNE2／DDP细胞的5-ALA-PDT组与空白对照组比较，Bax表达明显上调，Bcl-2表达显著下调，Bax／Bcl-2比值显著上调。3．结论：1．5-ALA-PDT既可以诱导CNE2或CNE2／DDP细胞凋亡，也可以通过光敏剂产生的活性氧物质杀伤肿瘤细胞。2．5-ALA-PDT通过光敏剂产生的活性氧物质杀伤CNE2的细胞的作用可能大于诱导凋亡，而对CNE2／DDP的诱导凋亡作用似乎占据优势。第四部分维拉帕米对5-氨基乙酰丙酸介导的光动力杀伤人鼻咽癌耐药／非耐药细胞作用的影响目的探讨维拉帕米对5-ALA-PDT杀伤耐药、非耐药鼻咽癌是否具有增效作用。1．方法1．1流式细胞仪检测VER对与5-ALA共孵育的CNE2或CNE2／DDP细胞内PpⅨ荧光强度的影响1．2荧光分光光度计法检测VER对与5-ALA共孵育的CNE2或CNE2／DDP细胞内PpⅨ荧光强度的影响1．3 MTT法检测VER对5-ALA-PDT杀伤CNE2或CNE2／DDP细胞作用的影响，设空白对照组、VER组、5-ALA组和5-ALA+VER组。2．结果：2．1 CNE2／DDP细胞5-ALA+VER组在各5-ALA浓度条件下，细胞内PpⅨ荧光强度显著高于5-ALA组，CNE2细胞内PpⅨ荧光强度有不同程度增加，但无显著性意义。2．2 CNE2／DDP细胞5-ALA+VER组在各5-ALA浓度条件下，细胞存活率明显低于5-ALA组；CNE2细胞5-ALA+VER组细胞存活率与5-ALA组相比，差异无显著性。3．结论：3．1维拉帕米可显著增强CNE2／DDP细胞内PpⅨ荧光强度，而对CNE2细胞内PpⅨ荧光强度无明显影响。3．2维拉帕米可显著增强对5-ALA-PDT对CNE2／DDP细胞的杀伤作用，而对5-ALA-PDT杀伤CNE2的作用无显著影响。