一、研究背景: 马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)，属真菌界，半知菌亚门，丝孢菌纲，丝孢目，青霉属，双轮青霉亚属，青霉种。马尔尼菲青霉感染人体后引起的一种严重的深部真菌病——马尔尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei，PMS)。多在中国东南部、泰国、马来西亚、新加坡等国家及我国的香港、台湾地区，偶在印度有病例报道，主要是感染免疫力低下的人群。马尔尼菲青霉在感染机体后，通常呈隐匿发病，临床表征成多样性如发热、贫血、淋巴结炎、肝脾肿大及皮肤软疣样皮疹等，且马尔尼菲青霉常引起AIDS患者及免疫力低下人群的严重感染，因此人们开始逐渐重视马尔尼菲青霉病的传播途径。 马尔尼菲青霉菌是青霉属300多种青霉菌中唯一的双相型真菌，25℃生长为菌丝相，以无性孢子的方式繁殖；37℃则呈酵母相，以无丝分裂的方式繁殖。竹鼠是马尔尼菲青霉的自然宿主，但传播给人类的机制尚未明了清楚。目前认为马尔尼菲青霉菌感染人体的可能途径是为孢子经呼吸道侵入宿主体内，马尔尼菲青霉菌的分生孢子与支气管上皮细胞的糖蛋白产生黏附后，肺泡的巨噬细胞将之吞噬，但马尔尼菲青霉酵母细胞能在巨噬细胞免疫系统压力、氧耗压力及营养缺乏的条件下启动相关基因，编码一系列毒力因子而有利于其在巨噬细胞内生存不被杀灭。分生孢子在人体37℃的环境下会发生双相型转变产生致病性的酵母相细胞，并存在于宿主的巨噬细胞内，随着巨噬细胞游走播散至全身各个器官。 宿主对抗细胞内病原体的重要免疫反应途径是通过固有免疫和适应性免疫。固有免疫是机体抵抗异物及病原的第一道防线，参与启动、调节、协同适应性免疫共同清除感染的病原体达到抗感染目的。固有免疫的效应细胞主要有中性粒细胞、单核—巨噬细胞等。但马尔尼菲青霉酵母相不但具有抵抗宿主免疫系统消灭的能力，而且能存活于宿主的巨噬细胞内，在巨噬细胞内存活的马尔尼菲青霉继续生长繁殖，并随巨噬细胞游走播散，造成系统性真菌病。 马尔尼菲青霉作为一种胞内寄生菌是如何逃避宿主免疫防卫机制的，尚有待进一步研究。宿主细胞可以与细胞内病原体反应产生凋亡，这是一种控制感染的机制。但也有一些微生物如肺炎衣原体、结核分枝杆菌能抑制凋亡，这是病原体在宿主细胞内生存和繁殖的策略。由此我们推论受感染的宿主细胞凋亡情况对于寄生于其中的马尔尼菲青霉的命运至关重要。了解马尔尼菲青霉能否诱导宿主细胞凋亡状态改变可能是理解马尔尼菲青霉致病机制的重要基础，也可能为发展新的抗真菌治疗、免疫干预策略提供切入点。 二、研究目的: 1.本课题拟在研究宿主细胞感染马尔尼菲青霉后细胞凋亡、凋亡途径与该菌胞内寄生的相关性。 2.了解宿主与马尔尼菲青霉间相互作用，以期进一步阐述马尔尼菲青霉的发病机制，为发展真菌病生物治疗、免疫干预策略提供重要理论基础。 三、实验对象与方法: 1.标本来源：分离自我科病人的马尔尼菲青霉临床株SUMS0152，37℃诱导转变成酵母相，收集酵母相菌株。 2.实验动物：BALB/c雌性5～8周小鼠，体重为20～25g之间，购自中山大学医学院实验动物中心。 3.实验分组：以不同时间4h、36h各分成空白对照组(PBS组)、实验组(马尔尼菲青霉组)。每组6只小鼠。 4.实验方法： 1)用瑞式染色进行细胞分类及计数。 2)采用流式细胞术检测4h、36h的小鼠腹腔细胞凋亡率。 3) RT—PCR法测定Capase—3、Fas、Bcl—2、Mcl-1的mRNA水平。 5.统计分析：计数炎症细胞比例采用卡方检验。依4h、36h实验组与空白对照组的细胞凋亡及不同凋亡因子的mRNA表达水平采用随机分组t—检验分析。P<0.05有统计学意义。全部统计用SPSS13.0统计软件包分析和Office2003软件在计算机上完成。 四、结果: 1.用瑞式染色后在光学显微镜下进行细胞计数，以计算启动炎症细胞的情况，结果表明在4h、36h时，有经马尔尼菲青霉刺激的小鼠的固有免疫效应细胞数比例(中性粒细胞、单核细胞)与空白对照组比较显著升高(P<0.05)。 2.利用流式细胞术检测小鼠腹腔内的炎症细胞，结果显示4h、36h均有抑制细胞凋亡的作用(P<0.05)，4 h实验组与36h实验组间无统计学意义(P>0.05)。 3.经小鼠体内培养马尔尼菲青霉4h后的凋亡因子Caspase—3、Fas的mRNA的表达量较空白对照组显著降低(P<0.05)，36h后实验组的mRNA表达量较4h实验组显著降低(P<0.05)。经小鼠体内培养马尔尼菲青霉4h后的抑制凋亡因子Bcl—2、Mcl-1的mRNA的表达量较空白对照组显着增高(P<0.05)，36h后实验组的mRNA表达量较4h实验组显着增高(P<0.05)。 五、结论: 1.马尔尼菲青霉在4h时诱发的炎症反应，可增强中性粒细胞和单核细胞趋化，经36h后，炎症细胞的趋化并未因机体的保护性免疫反应的发生而下降，表示马尔尼菲青霉可能为了生存而演化出抑制细胞凋亡的机制。 2.在不同时间(4h、36h)下小鼠腹腔炎症细胞的凋亡率均下降，但两个时间点间的凋亡率并无明显分别。表明马尔尼菲青霉会抑制宿主细胞凋亡，从而有利于马尔尼菲青霉在宿主细胞内繁殖及播散。 3.马尔尼菲青霉可能使Caspase-3与Fas的mRNA表达量下降及Bcl—2与Mcl-1的mRNA表达量提升，从而导致宿主细胞凋亡减少，这可能是马尔尼菲青霉得以存活并随宿主细胞游走播散的致病机制之一。 4.此结果可能为往后真菌病的临床治疗、免疫干预提供了新的思路和理论依据。