技术标准是保障乳品质量安全的重要技术支撑，我国乳品卫生标准体系中的微生物指标是与国际接轨过程中难度最大的部分。本课题通过充分查询调研国内外乳品（乳粉）标准，选择了影响乳品卫生安全最重要的微生物指标，比较发现目前我国乳品卫生安全标准中存在的差距；进一步通过实验，确立了牛乳中PCR快速检测大肠杆菌和双抗夹心ELISA快速检测高致病性大肠杆菌O157：H7两种方法。　　 国内外原料乳和乳粉微生物指标的比较。通过大量查阅书籍、网站和标准局数据库，将我国与国际组织及其他国家的原料乳和乳粉微生物指标及采样方法进行比较。比较中发现，中国认定的一级奶，在很多国家却被判定为不合格的原料乳（中国一级奶细菌总数要求小于等于50万个/毫升，而在美国不得超过5万个/毫升）；乳粉大肠菌群指标限量过高（中国限值90MPN/100g，美国10MPN/100g），分析原因主要是由于奶牛饲养分散，卫生条件难以控制所造成；我国一直沿用的乳品二级法采样限量标准未经风险评估，缺乏制订的科学依据。这就使得我国乳品在卫生安全和国际乳品贸易中处于较低的保护水平。　　 PCR法检测乳品中大肠杆菌的研究。本实验建立了PCR法检测乳品中大肠杆菌的检测体系。选择文献报道特异性较好的大肠杆菌的丙氨酸消旋酶基因（alr）片段为基础，设计引物，正反引物大小均为24bp，扩增产物为366bp大小的基因片段，并结合其他菌属的扩增特异性验证实验，确定了设计的引物具有属特异性。通过实验确定PCR最佳退火温度为66℃，PCR检测大肠杆菌基因组DNA检测限为1pg，1pg的细菌基因组DNA相当于100个细菌；比较和确定了牛乳中大肠杆菌DNA最佳提取方法，溶剂热裂解法；乳品中大肠杆菌的检测限为103CFU/mL，通过增菌实验，确定全脂和脱脂牛乳样品的增菌时间均为12h，检测限为2CFU/mL，与国标法相比，PCR法检测时间缩短、灵敏度较高，准确度与国标法相当。最终确定乳品中大肠杆菌的PCR法检测体系为：取乳样1mL→置于9mL pH7.0的麦糠凯肉汤增菌培养基中→37℃水浴振荡100r/min培养12h→再取1mL培养液→1200r/min离心20min去上清→溶剂热裂解法提取模板DNA→取上清液1μL作为模板→配制PCR反应体系进行PCR扩增→1.2％凝胶电泳检测→结果判断。　　 双抗夹心ELISA法检测牛乳中致病菌大肠杆菌O157：H7的研究。本实验建立了双抗夹心ELISA法检测牛乳中大肠杆菌O157：H7方法。分别采用煮沸灭活法制备大肠杆菌O157：H7的菌体抗原和改良热酚水法提取LPS脂多糖抗原，E.coli O157：H7菌体抗原和LPS抗原配比浓度：108-109CFU/mL和1200μg/mL，每只鸡每次注射配置好的免疫原1mL（0.5ml抗原+0.5ml佐剂），一免加不完全弗氏佐剂，每隔10天加强免疫一次，共加强免疫三次，采用间接ELISA方法监测效价，最高效价达到1：24000；采用水稀释法及DEAE-Sepharose离子交换色谱纯化制备两种特异性抗体anti-OH IgY和anti-LPS IgY，采用高碘酸钠氧化法将HRP酶标记到抗体anti-LPS IgY上，分别建立了以两种抗体为捕获抗体的双抗夹心ELISA法，抗体包被浓度为：anti-LPS IgY10μg/mL和anti-OH IgY12.5μg/mL，酶标抗体最适工作浓度为1：200，两种方法检测纯培养物中大肠杆菌的检测限为104CFU/mL，检测人工污染牛乳样品中大肠杆菌O157：H7，经过14小时增菌后，检测限均为SCFU/25mL，但是以anti-OH IgY为捕获抗体的夹心法本底较高。　　 本课题比较分析了国内外乳品微生物指标差别，完成了快速检测乳品中大肠杆菌PCR法及双抗夹心ELISA法快速检测牛乳中高致病性大肠杆菌O157：H7的建立，为适应乳品生产中实时监控大肠杆菌提供了有效的技术手段。