二酰胺类农药（氯虫苯甲酰胺、氟虫酰胺和溴氰虫酰胺）对鳞翅目、部分双翅目和鞘翅目害虫有很高的活性,而对其它目昆虫、哺乳动物和鱼类安全,因而广泛应用于靶标害虫的治理。对双翅目和鳞翅目代表性昆虫的研究表明,二酰胺类的作用靶标为鱼尼丁受体（Ryanodinereceptor,RyR）。但是,二酰胺类作用靶标的研究尚有四个方面的不足。（1）鱼尼丁受体是目前所知分子量最大的Ca2+离子通道,其编码基因超大,难以克隆。目前仍有多种重要害虫鱼尼丁受体基因的全长未知。（2）除双翅目和鱗翅目外的其它昆虫中,鱼尼丁受体是否为二酰胺类农药的靶标,尚需直接实验证据进一步证实。（3）昆虫鱼尼丁受体的晶体结构尚未解析,受体与二酰胺类农药结合的机制还认知不足。（4）二酰胺类杀虫剂对鳞翅目昆虫特异选择性的机理也尚未报道。鉴于此,本研究首先克隆了二酰胺类杀虫剂的非防控对象白背飞虱（Sogatella furcifera）、防控对象马铃薯甲虫（Leptinrotarsa decemlineata）和烟青虫（Helicoverpa assulta）鱼尼丁受体基因全长;采用RNA干扰方法明晰了白背飞虱和马铃薯甲虫鱼尼丁受体是氯虫苯甲酰胺的作用靶标;详细分析了烟青虫鱼尼丁受体基因的可变剪接和基因结构。同时,采用系统进化、同源模拟、分子对接等方法,综合比较了白背飞虱、马铃薯甲虫和烟青虫的鱼尼丁受体,预测了鱼尼丁受体与氯虫苯甲酰胺的可能结合位点,并初步分析了昆虫鱼尼丁受体对二酰胺类农药敏感性差异的机制。1.白背飞虱鱼尼丁受体基因的克隆及功能分析分段克隆白背飞虱鱼尼丁受体基因,采用RACE技术获得5’端和3’端,再经拼接组装得到了该基因（SfRyR）的cDNA序列全长。其长度为15985 bp,共编码5140个氨基酸。白背飞虱鱼尼丁受体与其它昆虫鱼尼丁受体的氨基酸水平相似性很高,达78%-97%,与哺乳动物的鱼尼丁受体相似性低于50%。白背飞虱鱼尼丁受体具有典型的保守结构,包括N端的1个MIR结构域、2个RIH结构域、3个SPRY结构域、4个RyR重复结构和1个RIH相关结构域,以及C端的2个与Ca2+结合的EF-hand基序和6个跨膜螺旋结构。喂食dsSyRyR1和dsSfRyR2后,白背飞虱鱼尼丁受体基因的表达量与对照相比分别下降77.9%和81.8%;使用20 μg/ml氯虫苯甲酰胺处理后;SfRyR被干扰的若虫,死亡率分别为22.1%和25.3%,而空白对照和dsegfp组若虫的死亡率分别为40.5%和48.2%。处理死亡率显著低于对照。这表明白背飞虱鱼尼丁受体是二酰胺类杀虫剂的靶标。2.马铃薯甲虫鱼尼丁受体基因的克隆及功能分析采用分段克隆和RACE技术,获得了马铃薯甲虫鱼尼丁受体（LdRyR）基因的cDNA序列全长。其长度为15792bp,编码5128个氨基酸。与其它昆虫鱼尼丁受体氨基酸相似性高达85%-92%,与秀丽隐杆线虫和人的鱼尼丁受体氨基酸相似性分别为59%和61%。马铃薯甲虫鱼尼丁受体基因拥有典型的结构特征,包括N端的1个MIR结构域、2个RIH结构域、3个SPRY结构域、4个RyR结构域和1个RIH相关结构域,以及C端有6个跨膜结构以及EF-hand基序。分别喂食幼虫和成虫dsLdRyR1和dsLdRyR2后,与对照CK相比,鱼尼丁受体基因的表达量都显著下降,幼虫表达量下降了 35.0%和45.0%,成虫下降55.2%和50.4%。用45μg/ml氯虫苯甲酰胺处理后,对照、dsegfp、dsLdRyR1和dsLdRyR2组幼虫死亡率分别为40%、33.3%、17.1%和18.3%,成虫分别为48.2%、45.8%、20.2%和19.7%。这证明马铃薯甲虫鱼尼丁受体是氯虫苯甲酰胺的作用靶标。3.烟青虫鱼尼丁受体基因的克隆、结构及可变剪接分析通过分段克隆和5’RACE的方法,获得了烟青虫鱼尼丁受体基因（HaRyR）的全长,共15414bp,编码5137个氨基酸。HaRyR与其它昆虫的氨基酸相似性为79%-99%。通过对氨基酸序列的分析,烟青虫鱼尼丁受体基因拥有典型的结构特征:N端有1个MIR结构域、2和RIH结构域、3个SPRY结构域、4个RyR结构域和1个RIH相关结构域;C端有6个跨膜结构以及EF-hand基序。通过比较cDNA与烟青虫基因组数据库,发现烟青虫鱼尼丁受体基因共包含110个外显子,外显子的大小范围为18-326 bp。比较克隆测序结果和基因组DNA的序列信息,详细分析了烟青虫鱼尼丁受体的可变剪接方式,发现32号、66号、67号、95号4个外显子共存在9种不同形式的剪接。同时测定了 4个外显子（32号、66号、67号、95号）不同形式的可变剪接体在卵、1龄、3龄、5龄、蛹、成虫6个不同发育时期的表达,发现这些可变剪接体表达频率在不同发育阶段差异很大,预示鱼尼丁受体序列多样性可能影响不同发育阶段昆虫对氯虫苯甲酰胺的敏感性。4.三种昆虫鱼尼丁受体的系统进化和结合位点预测对23个物种的27条鱼尼丁受体基因的系统进化分析以及9种昆虫的鱼尼丁受体基因结构及系统进化比较分析,发现昆虫鱼尼丁受体基因在蛋白水平进化上有很强保守性,但基因结构不同且存在巨大差异。利用同源建模的方法构建了鱼尼丁受体蛋白的三维结构以及C端的三维结构,白背飞虱、马铃薯甲虫和烟青虫的鱼尼丁受体结构相似,呈Y形状,C端呈倒Y形状;鱼尼丁受体C端的结构较整体结构更加保守。烟青虫鱼尼丁受体蛋白C端α-螺旋所占比例小于另外两种昆虫,表明烟青虫鱼尼丁受体蛋白柔韧性上强于白背飞虱和马铃薯甲虫的鱼尼丁受体。分子对接结果显示,3种昆虫的结合口袋各不相同,白背飞虱和马铃薯甲虫鱼尼丁受体活性口袋共轭体系比烟青虫鱼尼受体多,但配位键少。对3种昆虫鱼尼丁受体的3个结合位点及结合自由能分析结果显示,在主要可能结合位点1和2,白背飞虱和马铃薯甲虫鱼尼丁受体结合能力低于靶标昆虫烟青虫。这些结果预示:鱼尼丁受体的结构差异可能导致二酰胺类农药对昆虫的毒性差异。