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目的多梳抑制复合体2（PRC2）通过组蛋白甲基转移酶EZH2介导的组蛋白甲基化H3K27me3抑制基因表达。本研究旨在探究PRC2调控BRCA1（Breast cancer susceptibility 1）表达促进DNA双链损伤修复参与卵巢癌化疗耐药的作用与机制,并阐明BRCA野生型卵巢癌中PRC2抑制剂对顺铂和PARP抑制剂的增敏作用。方法1.顺铂刺激上皮性卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR4（均为BRCA野生型）,蛋白免疫印记实验（WB）检测双链损伤标记物P-H2AX及组蛋白修饰标记物H3K27me3、H3K4me3、H3K9me3、H3K36me3、H3K56ac、H3K36me2、H3K9me2,EZH2随着药物作用时间的变化。2.生理盐水或者顺铂刺激OVCAR4细胞系,免疫共沉淀（Co-IP）检测双链损伤位点P-H2AX上H3K27me3、H3K4me3、H3K9me3、H3K36me3、H3K56ac、H3K36me2、H3K9me2、EZH2的结合及富集。3.DMSO（溶剂对照）或者PRC2抑制剂GSK126预处理SKOV3和OVCAR4细胞48小时,再分别予以顺铂刺激24小时,WB及实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测BRCA1蛋白及mRNA表达水平。4.利用CRISPR/cas9-sgRNA慢病毒系统敲低EZH2（SKOV3sgEZH2、OVCAR4 sgEZH2）,或GSK126处理卵巢癌细胞后,WB检测H3K27me3的表达。5.免疫荧光检测P-H2AX评估SKOV3,OVCAR4细胞中PRC2的抑制对顺铂介导的DNA双链损伤的影响。6.流式细胞术检测DR-GFP报告质粒,评估PRC2功能对同源重组修复的影响（DR-GFP报告质粒中的I-Sec核酸酶可以剪切DNA双链造成双链损伤,若损伤能被HR修复（Homologous recombination repair）,细胞会表达绿色荧光蛋白）。7.siRNA慢病毒载体构建BRCA1缺陷细胞株SKOV3siBRCA1和OVCAR4siBRCA1。另设卵巢癌细胞GSK126预处理组。给予顺铂cDDP和/或PARP抑制剂AZD（AZD2281,奥拉帕尼）,流式细胞凋亡和克隆形成实验检测药物的细胞毒性,评估PRC2抑制剂是否能实现类似于BRCA1缺陷联合PARP抑制剂的合成致死效应。8.流式细胞凋亡和克隆形成实验检测GSK126对cDDP单药以及cDDP联用AZD化疗的增敏作用。9.流式细胞凋亡检测评估单用GSK126和GSK126联合AZD对卵巢癌细胞的杀伤作用。10.SKOV3细胞系建立小鼠皮下移植瘤模型,成瘤后的裸鼠随机分为四组:（1）cDDP+溶剂对照（2）cDDP+GSK126（3）cDDP+AZD（4）cDDP+AZD+GSK126,监测瘤径、小鼠体重、精神状态,评估不同药物联用的肿瘤生长抑制作用及药物的毒副作用。11.免疫组织化学染色（IHC）检测裸鼠瘤组织内EZH2、Ki67（核增殖抗原）、Cleaverd-caspase3（凋亡蛋白）、H3K27me3,评估药物联用对移植瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果一、组蛋白甲基化参与顺铂介导的DNA损伤反应1.双链损伤标记物P-H2AX及组蛋白修饰标记物H3K27me3、H3K4me3、H3K9me3、H3K36me3、H3K56ac随着顺铂作用时间的延长而升高,H3K36me2、H3K9me2、EZH2无明显变化。2.P-H2AX免疫沉淀中可检测到H3K27me3、H3K4me3、H3K9me3、H3K36me3、H3K56ac、H3K36me2、H3K9me2、EZH2。二、PRC2抑制剂对抗顺铂介导的BRCA1上调。cDDP处理亲本卵巢癌细胞后BRCA1蛋白表达显著升高,而经GSK126预处理的卵巢癌细胞cDDP处理后BRCA1表达比仅用cDDP显著降低;单用GSK126处理不影响BRCA1表达。三、抑制PRC2降低卵巢癌同源重组修复增加双链损伤。1.CRISPR/cas9-sgRNA慢病毒显著下调卵巢癌细胞EZH2和H3K27me3表达;GSK126不影响EZH2表达,但可有效抑制H3K27me3。2.P-H2AX免疫荧光检测显示下调EZH2表达或GSK126处理均可增加DNA双链损伤。3.DR-GFP报告实验结果显示下调EZH2表达或GSK126处理均可抑制卵巢癌细胞同源重组修复。四、抑制PRC2可增加BRCAwt卵巢癌对顺铂和奥拉帕尼的敏感性。1.与对照组相比,类似于siBRCA1组卵巢癌细胞,GSK126预处理的卵巢癌细胞中cDDP和AZD的促凋亡和抑制克隆形成作用显著增强。2.与单用cDDP相比,cDDP/GSK126联用组细胞克隆形成能力显著减弱,且凋亡增多;cDDP/GSK126/AZD三药联用组比两药联用组（cDDP/GSK126和cDDP/AZD）的抑制克隆形成、促凋亡作用更为显著。3.GSK126单独使用或与AZD联合使用对卵巢癌细胞的无促凋亡作用。4.动物实验结果显示:与单用cDDP相比,三药联用组、cDDP/GSK126组、cDDP/AZD组肿瘤体积分别下降了92%、42%、36%（P均<0.01）;各组间裸鼠体重无显著差异。5.皮下瘤IHC染色结果显示:H3K27me3在含GSK126的给药方案处理组中显著下调,Ki67在三药联用组、cDDP/GSK126组、cDDP/AZD组、单用cDDP组依次升高,Cleaved-caspase3则相反。结论抑制PRC2功能可纠正顺铂介导的卵巢癌细胞BRCA1高表达,从而抑制同源重组修复功能,促进损伤积累,进而增加BRCAwt卵巢癌对顺铂和奥拉帕尼的敏感性。