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第一部分BMP7蛋白对骨髓基质细胞定向分化作用的实验研究华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科博士研究生：李宽新导师：李锋教授摘要目的：(1)探讨体外分离、培养及诱导大鼠BMSCs的方法；(2)建立BMP7体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞的实验条件；(3)通过观察BMP7诱导分化后骨髓源性神经样细胞的形态和标志物指标,评价BMP7诱导BMSCs分化为神经样细胞的生物学作用。方法：(1)应用全骨髓贴壁法分离、培养、纯化大鼠BMSCs;(2)采用免疫化学方法(免疫荧光技术)测定大鼠BMSCs阳性表达的表面标志物CD29、CD44、CD90的情况及阴性标记物CD34、CD45的情况；(3)在3d、1w、2w、4w时间点检测,测定不同浓度BMP7诱导分化的骨髓源性神经样细胞的细胞活力和阳性率,建立BMP7诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞本实验的最佳条件；(4) Western blot技术和免疫荧光方法测定神经元样细胞内神经细胞标记物(NSE)、神经细胞树突标志物(MAP-2)、星形胶质细胞标记物(GFAP)的在蛋白的定位以及表达情况；(5) RT-PCR检测诱导后细胞内NSE及MAP-2及mRNA的表达。结果：(1)采用全骨髓贴壁法,于我们实验室培养环境下,适应简单而高效的BMSCs的分离及培养实验室条件；(2) BMSCs免疫荧光方法检测结果提示：于我们实验室环境下培养的BMSCs,其表达BMSCs表面标志物CD90、CD29和CD44,造血干细胞的表面标记物CD45、CD34不表达(3)加入含BMP7的诱导液,3d后,在倒置相差显微镜下观察,可以看到诱导组细胞部分出现形态改变,胞体折光性增强,并伸出较多的细长突起,有的还有1-2级分支,部分细胞突起与突起间互相连接,呈现出神经元样细胞形态。随着诱导时间的延长,神经元样细胞数目增多,突起变长。诱导1w后,形成双极或多极细胞,细胞突起更多更明显,多个突起发出分支相互交织成网。3w后神经元样细胞数量开始减少；对照组细胞形态基本无变化仍呈长梭形漩涡状生长。(4)不同浓度BMP7诱导BMSCs分别于3d、1w、2w、4w培养时间点,骨髓源性神经样细胞细胞活力和阳性率测定结果提示：25ng/ml组骨髓源性神经样细胞阳性率均明显低于50ng/ml组(P<0.01),然而实验计量在50ng/ml组以上随着BMP7浓度增高,骨髓源性神经样细胞阳性率表现下降趋势,50ng/ml诱导后1w骨髓源性神经样细胞阳性最高,并且细胞活力以时间逐渐延长则出现下降趋势；1w诱导组活细胞率均大于82%,其中25ng/m1、50ng/m1、75ng/ml BMP7组细胞活力高于对照组(P<0.01)。可以提示50ng/ml BMP7诱导大鼠骨髓基质细胞,这样诱导效果最佳；(5) 50ng/ml BMP7诱导BMSCs于1w后的骨髓源性神经元样细胞Western Blot杂交检测和免疫荧光方法测定结果提示：同对照组相比BMP7诱导组分化的细胞定位于胞浆的NSE、MAP-2均出现表达,而定位于胞浆的GFAP没见有表达；(6)50ng/ml和75ng/ml大鼠BMSCs经BMP7诱导后检测结果显示NSE和MAP-2mRNA扩增产物在373bp处出现目的条带；MAP-2mRNA扩增产物在513bp处出现目的条带。结论：(1)本实验室环境内搭建了,体外分离、培养大鼠BMSCs的条件和方法,分离培养出细胞活性好,纯度较高的大鼠骨髓基质细胞；(2)BMP7能诱导大鼠骨髓基质细胞出现类神经元样的形态变化,诱导后的骨髓源性神经元样细胞能表达神经细胞的特异性标记物。第二部分：骨形成蛋白7对大鼠急性脊髓损伤修复作用的实验研究目的：建立更为合理的急性脊髓损伤动物模型,用于评价与研究应用BMP7蛋白对脊髓损伤修复再生的治疗作用。探讨BMP7蛋白对脊髓损伤后神经元修复及髓鞘再生的作用机制,为治疗脊髓损伤寻找一种新的有效治疗方法。方法：用改良Allen法制成Wistar大鼠T10急性脊髓损伤(SCI)动物模型,术后分别按照空白对照组(DMEM)组和BMP7组移植入脊髓损伤部位,移植后6h、3d、1w、2w、4w、8w后分别采用BBB运动评分及斜板试验观察大鼠双后肢运动功能恢复情况。同时采用脊髓诱导电位(MEP)评价治疗效果。取材后行HE染色观察脊髓损伤,应用免疫组化技术、Western-blot杂交检测神经中丝蛋白(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及核突触素(SYP)的表达情况。结果：移植4w后,BMP7移植组细胞呈阳性表达,同时免疫组化检测可见明显的NSE MAP-2及GFAP蛋白的表达,随着时间的延长,在4w、8w其阳性细胞检出率很低。BMP7移植治疗组4w和8w后,BBB评分及斜板试验的结果比对照组均有明显增高(P<0.05),4w和8w后实验组取材前所获得的MEP波形多呈M形的双峰波,波幅较损伤后明显恢复。脊髓损伤处的空洞面积显著减小(P<0.05),免疫印迹方法和Western-blot杂交检测实验组的NF-200、GFAP及SYP在蛋白水平的表达。结论：大鼠急性脊髓损伤后1-2周是神经元及其细胞再生的关键时期,及时给予一定浓度的BMP7能够促进神经元修复和轴突再生,并能促进大鼠后肢运动功能的恢复。关键词：急性脊髓损伤；BMP7蛋白；移植Part1 Experimental Study on the action of BMP7 in the differentiation of Bone marrow stromal cells Department of Orthopaedics, TongJi Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology Doctoral Candidate:Li Kuanxin Doctoral Supervisor:Prof. Li Feng AbstractObjective:1. To investigate the way of isolation, culture and induction of bone Marrow stromal cells (BMSCs) of rat in vitro.2. To explore the suitable condition, by which the BMSCs can be induced into neuron-like cells with BMP7.3. To evaluate the effect of Neuritin by observing the morphology and the molecular marker of the neuron-like induced with BMP7.Method:1. The BMSCs of rat were cultured and purified with the method of adherence of all Bone marrow cells.2. CD44,CD29,CD90,CD34andCD45 of rat BMSCs were detected by immunofluorescence technology.3. The positive rate of neuron-like cells and cell vitality were detected at 3d,1w,2w and 3w in order to build the suitable condition of induction.