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本文以表达人类可溶性Fas配体的重组盘基网柄菌AX3—pLu8为研究对象,通过液芯羧甲基纤维素纳—海藻酸钙(CMC—ALG)生物微胶囊的固定化培养,提高其细胞密度,进而提高目标蛋白FasL的产量。分别采用了半自动装置和高压静电装置制备CMC—ALG生物微胶囊,并优化了制备条件和培养条件。此外,还研究了微胶囊化重组盘基网柄菌在自循环流化床中的生长情况,初步实现了放大培养。
以复合培养基HL—5C为起点,首先考察了半自动装置制备的CMC—ALG生物微胶囊的各制备组分对重组盘基网柄菌生长的影响并应用该微胶囊固定化培养盘基网柄菌。结果表明CMC—ALG生物微胶囊与重组盘基网柄菌有着良好的生物相容性;通过考察不同组分浓度制备而成的CMC—ALG微胶囊内重组盘基网柄菌的生长情况,得到较适的制备组分配比为CMC12g·L-1,SA8g·L-1,CaCl2100 g·L-1,制备反应温度为20℃,阳离子溶液滴加速度为6 mL min—1,凝胶反应时间为10~15min,培养基与微胶囊的体积比为10:1,摇床转速为170 r min—1。在以上较适条件下制备的微胶囊内重组盘基网柄菌的生长得到了极大的改善,最大的细胞密度比游离培养时提高了3倍,达到8.03×107mL-1;相应的人类可溶性Fas配体(FasL)的表达水平也提高了1.5倍,达到315μg·L-1。此外,开展了微胶囊化重组盘基网柄菌的二次重复发酵FasL的研究,结果表明,最大细胞密度可达到1.24x108 mL-1,为游离培养的8~10倍,FasL仍维持高水平表达(280μg·L-1),为游离培养时的2倍。
其次,开展了高压静电装置制备CMC—ALG生物微胶囊的研究,优化了其制备条件,为电压2.9 kV,推进速度60 mm·h—1,液面距20 mm;考察了采用高压静电法微胶囊化的盘基网柄菌在合成SIH培养基中的生长情况,获得的细胞最大密度可达9.05x107mL-1,相应的FasL的最大产量为354μg·L-1;在SIH/HL—5C配比为1:1的混合培养基中,三批重复培养微胶囊化盘基网柄菌,结果过程中细胞密度和代谢产物的量不断增大,长时间维持在较高的细胞密度有利于FasL等代谢产物的积累,提高目标蛋白的产量。
自行制备了循环流化床装置,优化了微胶囊化重组盘基网柄菌在自循环流化床中培养的重要参数:通气速度为0.4 L·min—1,循环培养基流速为5 mL·min—1;微胶囊化的重组盘基网柄菌在自循环流化床和外加循环流化床间歇培养时,最大细胞密度和FasL的表达量均达到较高水平,而在其连续培养过程中,囊内的细胞密度和FasL的表达量略低于间歇培养时的情况。