构建表达内皮抑素(endostatin)基因的条件复制型腺病毒载体，在体、内外研究其对肝癌生长的抑制作用、及作用机制以及治疗的有效性、安全性；研究磁性壳聚糖纳米颗粒对条件复制型腺病毒载体靶向定位及、基因转染、治疗安全性的作用。方法以野生型腺病毒Ad5基因组为模板，利用PcR分别扩增腺病毒基因组E1a、E1b19k序列，自pSP—elado—eGFP质粒中切取endostatin—eGFP融合基因，依次将以上基因序列克隆到腺病毒包装系统中的穿梭质粒pDC316中，然后与腺病毒骨架质粒pAdeno-X共同转染低传代的293LP细胞中进行病毒包装；包装成功的病毒利用高传代的293ST细胞进行病毒扩增，然后进行病毒的纯化、鉴定；利用流式细胞术分析病毒载体在肝癌细胞HepG<,2>和人脐静脉血管内皮细胞HUVEC中的转染效率；利用RT—PCR、免疫组织化学技术、Western Blot、ELISA技术检测不同基因载体对目的基因表达的影响；利用PCR技术、腺病毒滴度检测试剂盒以及透射电镜检测病毒转染后细胞内病毒颗粒的复制；利用MTT试验检测病毒载体对细胞增殖的影响；利用流式细胞术检测病毒载体对细胞周期及细胞凋亡的影响；利用划痕试验检测endostatin对血管内皮细胞迁移功能的影响；构建肝癌的裸鼠移植瘤模型，通过瘤内注射给药，观察肿瘤体积的变化，绘制肿瘤生长曲线；利用ELISA试剂盒检测试验动物外周血中内皮抑素的表达水平；处死试验动物后,HE染色观察试验动物肿瘤组织以及其它脏器的病理改变；利用PCR检测肿瘤组织及其它脏器、组织中病毒的分布情况；利用RT—PCR检测肿瘤组织及其它脏器、组织中内皮抑素的表达情况；肿瘤组织石蜡切片，利用免疫组织化学染色检测观测内皮抑素在肿瘤组织中的表达；利用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中肿瘤血管密度；采用乳化交联法制备磁性壳聚糖颗粒；将病毒载体与磁性壳聚糖颗粒耦联，紫外分光光度计法及腺病毒壳蛋白免疫法检测壳聚糖磁化病毒颗粒的磁性趋动效应；流式细胞术法检测壳聚糖磁化病毒颗粒的转染效率；MTT法检测磁性壳聚糖纳米颗粒对细胞的毒副作用；RT-PCR检测磁性壳聚糖纳米颗粒对内皮抑素基因表达的影响；构建裸鼠肝癌移植瘤模型，瘤内注射磁性纳米颗粒耦连的条件复制型腺病毒载体并在肿瘤局部加以磁场诱导，观察病毒在体内的分布。成功构建了表达内皮抑素的条件复制型腺病毒载体crAd-endo-eGFP及不含治疗基因的条件复制型腺病crAd-eGFP，并加以大规模扩增、纯化；利用流式细胞术分析crAd-endo-eGFP的转染效率明显高于质粒pShuttle-endo-eGFlP的转染效率；RT-PCR、免疫组织化学技术、Western Blot、EIJISA均检测到了crAd-endo-eGFP转染细胞后内皮抑素的表达，其中转染了crAd-endo-eGFP病毒的HepG<,2>细胞内endostain的表达量明显高于转染了相同拷贝数复制缺陷型腺病毒载体Ad-endo-eGFP的细胞，而在HUEVC中，两种病毒无明显差别；转染细胞后，肝癌细胞株HepG<,2>中，crAd-erldo-eGFP及crAd-eGFP的病毒拷贝数目明显高于Ad-endo-eGFP及Ad-eGFP，而在人脐带静脉血管内皮细胞HUEVC中，病毒拷贝数目并无明显区别；复制型的crAd-endo-eGFP对HepG<,2>细胞的增殖抑制率明显高于复制缺陷型的Ad-endo-eGFP，而对于HuEVC细胞两者并无明显区别；流式细胞术检测crAd-endc-eGFP可以使HUVEC细胞周期阻滞在G1期，并诱导细胞的凋亡；细胞划痕试验表明crAd-endo-eGFP可以明显抑制血管内皮细胞的迁移能力；在动物体内，crAd-end0-eGFP 可以抑制肿瘤的生长，并进一步缩小肿瘤体积，并且呈现一定的剂量依赖性，其治疗效果明显好于复制缺陷型的Ad-endo-eGFP； RT-PCR和免疫组织化学染色均检测到了endostatin在肿瘤组织中的表达；HE染色crAd-endo-eGFP治疗组肿瘤组织内有明显的坏死灶，其它脏器组织内无明显改变；PCR检测病毒DNA，发现肿瘤组织内和肝脏组织内存在腺病毒E2基因，尤以肿瘤组织内为高，其它脏器组织均未检测到E2基因；CD31血管内皮细胞免疫组织化学染色证实crAd-endo-eGFP治疗组肿瘤组织内血管数目明显减少；壳聚糖磁性纳米颗粒耦连后的crAd-endo-eGFP在磁场的作用下具有磁性驱动效应；磁性纳米颗粒在体外在磁场的作用下可以一定程度上提高病毒载体在HUVEC细胞的转染效率；MTT检测磁性壳聚糖纳米颗粒对体外培养的肿瘤细胞及HUVEC细胞均无毒副作用；RT-PCR检测显示磁性壳聚糖纳米颗粒耦连后的病毒载体内皮抑素表达水平并无明显改变；体内实验表明，磁性壳聚糖纳米颗粒耦连病毒后，在外周磁场的作用下可以使得病毒载体局限在肿瘤局部，肝脏中病毒拷贝数明显减少。结论条件复制型腺病毒载体的改造包装过程中，穿梭质粒的改造是主要内容；表达内皮抑素基因的条件复制型腺病毒载体crAd—endo—eGFP可以明显杀伤肝癌细胞HepG<,2>，其机制主要是由病毒复制导致的细胞死亡破裂以及表达的endostatin基因对细胞的抑制作用；crAd—endo—eGFP在体内不但可以通过外源性表达内皮抑素抑制血管内皮细胞HUEVC的增殖及其迁移能力从而抑制肝癌血管新生，进而抑制肝癌生长，还可以通过自身复制导致肿瘤细胞死亡，发挥溶瘤作用，从而抑制肿瘤生长，缩小肿瘤体积；磁性壳聚糖纳米颗粒对细胞无毒副作用，利用其耦连病毒载体后可以增加病毒载体的磁场靶向性，从而提高基因治疗过程中的安全性。