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目的:本研究旨在应用小鼠杂交瘤技术制备能够识别人血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VECDH5),以下称CDH5蛋白的单克隆抗体,探讨CDH5在肿瘤组织中的表达及单抗的相关功能,并且进一步研究CDH5与肿瘤新生血管的关系,为后续相关研究提供实验基础。同时建立检测人血浆可溶性CDH5双抗体夹心ELISA方法,为疾病的诊断及预后评估提供更好的临床检验方法。方法:采用PCR技术体外扩增CDH5胞外区基因片段,将该片段插入带有His标签的原核表达载体p ET-41a,诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和纯化CDH5重组蛋白,采用紫外分光光度计、SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色分析蛋白质浓度和纯度;利用经典杂交瘤技术制备抗CDH5的单克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)、免疫荧光(Immunofluorescence)和免疫组化(Immunohistochemistry)方法验证单抗与CDH5的特异性结合能力;利用p ET-41a载体分段表达CDH5胞外区,通过Western Blot初步确定单抗抗原表位所在区域,利用该区域合成肽进行斑点印迹(Dot Blot)及竞争法ELISA进一步分析单抗表位;所制备的单抗行免疫组化检测CDH5在各种类型肿瘤标本中的表达;体外3DMatrigel血管形成实验探究CDH5单抗对肿瘤血管新生及血管生成拟态(Vascular mimicry,VM)的作用;细胞黏附实验、CCK-8检测单抗对细胞黏附、细胞增殖的影响;Western Blot检测PI3K/AKT/β-catenin信号通路中相关蛋白的表达;选取效价和亲和力较高的几株单抗,采用棋盘格滴定法筛选出最佳双抗体组合,建立检测人血浆可溶性CDH5双抗体夹心ELISA方法,并进行方法学评价。结果:1.成功构建了p ET-41a/CDH5-N-ter重组质粒,诱导CDH5-His重组蛋白表达,大小约70 k Da,与预期大小一致,经纯化后考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度高,能用于免疫小鼠。2.杂交瘤细胞经间接ELISA检测成功筛选出一株功能性单抗2C11,抗体效价为1:8000。Western Blot、免疫荧光及免疫组化方法提示单抗2C11能够特异性识别天然CDH5蛋白,且CDH5定位于内皮细胞的细胞连接处并在黑色素瘤中存在表达;为鉴定抗原表位,正确构建了p ET41a/CDH5胞外区重组质粒用于分段表达CDH5 N端蛋白,考马斯亮蓝染色显示诱导细菌裂解后上清蛋白大小与预期一致,Western Blot显示2C11能够识别CDH5蛋白第351-456个氨基酸组成的蛋白,进一步的Dot Blot法显示2C11的抗原表位位于LDREVVPWYNLTVEA。3.免疫组化结果显示,CDH5在人肾癌、肠癌和肺癌组织均有表达;体外3DMatrigel血管形成实验证实该单抗相较于阴性对照组具有抑制肿瘤血管形成的能力(P<0.05);细胞黏附实验说明该单抗相较于对照组具有降低细胞黏附能力的作用(P<0.05);CCK8实验结果表明单抗2C11能抑制细胞增殖(P<0.05);Western Blot实验显示P-AKT和β-catenin水平下降(P<0.05)。4.与此同时,通过筛查配对,选取4E6和9A6两株单抗成功建立检测人血浆可溶性CDH5的双抗体夹心ELISA方法,该法的检测限为24.7 pg/ml,批内变异系数(CV)为4.1%-7.7%,批间CV为8.7%-10.8%,平均回收率为96.7%。结论:(1)利用杂交瘤技术成功制备了一株效价高、特异性好的单克隆抗体2C11,可用于Western Blot、免疫荧光和免疫组化检测CDH5的表达情况,并成功鉴定出抗原表位。(2)CDH5在肾癌、结肠癌、黑色素瘤中均存在表达,同时筛选出CDH5在肺腺癌细胞株中存在表达,单抗2C11具有抑制肿瘤细胞增殖的能力。单抗的功能研究说明2C11在体外能抑制肿瘤血管生成。此过程涉及到VM的发生发展,相关蛋白分子表达水平的检测提示CDH5作为VM发生发展的重要环节,影响细胞的增殖从而进一步参与肺癌的发生发展过程。(3)建立的双抗体夹心ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性,可用于人血浆中可溶性CDH5含量的检测,并可作为肿瘤诊断的一种新检测手段。