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目的各种原因造成的视网膜组织细胞损伤最终会导致不可逆的视力下降。减轻疾病过程中的炎症、保护营养视网膜神经细胞是目前多种视网膜疾病治疗研究的热点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有促进组织损伤修复和神经保护的功能,已在多种动物模型中得到验证。最新研究表明,MSCs分泌的外泌体(exosomes derived from mesenchymal stem cells,MSC-exos)可以介导多种MSCs的生物学功能。本实验采用视网膜激光损伤模型,观察MSCs及MSC-exos对网膜激光损伤治疗作用,并初步探讨其作用机制,为MSC-exos在眼部疾病中的应用奠定基础。方法1.培养MSCs:体外培养原代人脐带来源的MSCs,并传代扩增。2.提取并鉴定MSC-exos:收集3代及4代MSC培养上清液,梯度离心后磷酸盐缓冲液(PBS)重悬exos,蛋白质谱分析及电镜观察法鉴定MSC-exos,BCA蛋白定量试剂盒测量浓度。3.建立视网膜激光损伤动物模型:80只C57BL/6小鼠随机分为正常组(5只)、对照组(25只)、MSCs治疗组(25只)及MSC-exos治疗组(25只)。激光光凝方式建立视网膜激光损伤模型。4.选取MSC-exos最佳治疗浓度:随机选取21只C57BL/6小鼠,分为7个不同浓度组,激光损伤其右眼视网膜后,不同浓度MSC-exos各5μl玻璃体腔注射治疗,3天后测量组织病理学指标并统计分析。5.MSCs及MSC-exos治疗:激光损伤后立刻对MSCs治疗组玻璃体腔注射5μl细胞悬液(含1×103个MSCs),MSC-exos治疗组玻璃体腔注射5μl exosomes(上述所明确的最佳治疗浓度),对照组玻璃体腔注射同体积PBS。6.苏木素-伊红(HE)染色观察组织病理学变化:分别于损伤后1天、3天、7天和14天处死各组小鼠并摘除眼球,连续石蜡切片,选取各激光斑中心处切片,通过HE染色观察视网膜组织形态,并测量激光斑直径和外核层缺损区域直径。7.原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况:在以上各时间点处死各组小鼠并摘除眼球,连续石蜡切片,选取各激光斑中心处切片,TUNEL法检测细胞凋亡,并进行凋亡细胞计数。8.视网膜电图(ERG)检测视功能:在损伤后1天、3天、7天和14天,各组小鼠经8小时暗适应后,用眼电生理检查系统检测视细胞产生电位的振幅,以评估视功能。9.检测MCP-1、TNF-α和c-Met的基因表达情况:分别于组织病理学检测的4个时间点处死各组小鼠并摘除眼球,提取视网膜RNA,荧光实时定量PCR(FQRT-PCR)检测单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),肝细胞生长因子受体(c-Met)的基因表达情况。结果1.成功培养原代人脐带来源MSCs,并传至4代,并成功从其上清液中提取exosomes,蛋白质谱分析不同批次,均有CD9和CD81表达,电镜观察到纳米级囊泡。2.0.5mg/ml为MSC-exos的最佳治疗浓度。3.成功建立小鼠视网膜激光损伤模型。4.HE染色显示两治疗组组织损伤较轻。损伤后一天,激光斑直径三组间无统计学差异(P>0.05);光凝后3天、7天和14天,激光斑直径和外核层缺损直径两治疗组均小于对照组(P<0.05),MSCs治疗组与MSC-exos治疗组间无统计学差异(P>0.05)。5.视网膜损伤后第1、3天,对照组及治疗组小鼠视网膜激光斑中心处可见大量凋亡细胞。两治疗组平均细胞凋亡数均小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两治疗组相比差异无统计学意义(P>0.05);第7、14天,凋亡细胞数变少并渐趋于正常,三组之间平均凋亡细胞计数无统计学差异(P>0.05)。6.暗适应ERG结果显示:损伤后第1天,a波、b波振幅三组间均无统计学差异。之后的三个时间点中,两治疗组与对照组之间a波、b波振幅均有统计学差异(P<0.05),任一时间点,两治疗组间各波振幅均无统计学差异(P>0.05)。7.FQRT-PCR检测发现激光损伤后第1天和第3天,两治疗组MCP-1的mR NA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);激光损伤后第1天,两治疗组TNF-α的mR NA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两治疗组c-Met的mR NA表达水平在损伤后第1、3和7天低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论玻璃体腔注射MSCs或MSC-exos均能有效改善小鼠视网膜激光损伤后的组织结构和功能,减轻炎症反应,减少细胞凋亡。