研究背景:在自然界中,细菌主要以浮游和生物膜两种形式存在,并在这两种状态下相互转换以适应环境,从而形成了细菌生物膜的周期循环。与浮游型细菌不同,当细菌作为生物膜生长时,其对抗菌剂、宿主防御机制对其清除等具有自发地抵抗作用,并且其代谢活性和基因表达也有所不同。与浮游型相比,当牙龈卟啉单胞菌作为生物膜生长时,约18%的基因组差异性表达。在临床上,种植体植入后的5到10年,有10%的种植体及20%的种植患者发生种植体周围炎。而由于种植体周围炎导致的种植失败病例占总失败病例的30%。菌斑生物膜作为一种典型的生物膜结构,是种植体周围炎发生和/或发展的始动因素。与种植体周围炎最为密切相关的致病菌群被称为“红色复合体”,包括:牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌和齿垢密螺旋体。其中,牙龈卟啉单胞菌在种植体周围炎模型的“红色复合体”中占比高达50%,故牙龈卟啉单胞菌被认为是种植体周围炎的主要致病菌。然而,目前临床上并没有高效且能够确保不损伤种植体或周围组织的治疗种植体周围炎的方法。几乎所有细菌都会在细胞膜外形成细胞壁。细胞壁作为一层网状的弹性结构强有力地对抗着外界压力、维持细胞形态,并作为细菌抵御物理、化学、生物学威胁的有效屏障。在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中,细菌细胞壁由肽聚糖聚合物组成,其主要成分是肽聚糖。肽聚糖作为细菌重要细胞壁组成结构,一方面保持了细胞结构的完整性并减少细胞生长过程中的机械和渗透损伤,另一方面能协助细胞的生长,分裂及细菌的鞭毛运动。肽聚糖的化学结构是动态的,许多物质均是通过破坏肽聚糖结构或抑制肽聚糖合成从而发挥抑菌或杀菌作用的,如溶菌酶作用于N-乙酰胞壁酸,青霉素抑制转肽酶的活性,抑制肽桥形成。而在细菌生长进入稳定期时,肽聚糖经常被修饰。D-氨基酸与L-氨基酸互为对映异构的手性分子,具有相似的物理化学特性及特征,在生物学功能上可能具有相似或相反的特性。在各种生命活动中起主导作用的L-氨基酸,能够抑制铜绿假单胞菌的移动,并且能够通过提高细胞内c-di-GMP的水平从而促进生物膜的形成。近年来,D-氨基酸的研究受到了广泛的关注。Kolodkin-Gal等学者研究发现,枯草芽孢杆菌生物膜分解期的上清液提取物中含有D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸和D-色氨酸,这些提取物一方面可以抑制生物膜的形成,另一方面能够促使成熟生物膜分散。不同种类D-氨基酸对于不同种类细菌生物膜的作用也不尽相同。在大肠杆菌、根癌土壤杆菌和枯草芽孢杆菌中,D-氨基酸通过整合到胞壁肽的第四/五位点,抑制细菌生物膜的形成。然而,没有一种L-氨基酸可以对细菌细胞壁进行重塑。目前,关于D-氨基酸对微生物生物膜的研究主要集中在枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等;然而,牙龈卟啉单胞菌作为种植体周围炎发生及发展的主要致病菌,D-氨基酸作用于牙龈卟啉单胞菌生物膜的研究较少。目的:本实验通过研究D-苯丙氨酸对牙周疾病主要致病菌——牙龈卟啉单胞菌生物膜的影响,探索有效D-苯丙氨酸浓度对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的抑制作用以及D-苯丙氨酸与其对映异构体L-苯丙氨酸的相互作用关系。实验结果能够为种植体周围炎的临床治疗新策略提供一定的理论依据,有望控制种植体周围炎的发生发展,维持种植义齿的长期稳定性。方法:本实验通过制备D-苯丙氨酸的饱和溶液,并分别稀释至饱和浓度的100%、75%、50%、25%、10%、1%、0.1%。将牙龈卟啉单胞菌菌液分别与梯度浓度的D-苯丙氨酸溶液共培养72小时。通过扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察D-苯丙氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形态的影响,利用结晶紫染色法检测D-苯丙氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜生物量的影响,活死细菌染色法观察D-苯丙氨酸对牙龈卟啉单胞菌细菌活性的影响,通过苯酚-硫酸法检测D-苯丙氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的胞外多糖含量的影响。根据上述实验所得结果,利用与有效浓度的D-苯丙氨酸溶液同等浓度同等剂量的L-苯丙氨酸溶液,进行SEM观察生物膜、结晶紫染色、活死细菌染色、苯酚-硫酸法实验,以确认D-苯丙氨酸与其手性分子L-苯丙氨酸在此研究中的相互作用关系。结果:与对照组相比,当D-苯丙氨酸溶液浓度≥80mM时,P.gingivals ATCC 33277细菌生物膜的生物量具有统计学差异(P<0.05);当D-苯丙氨酸溶液浓度在0.16mM至40mM之间时,P.gingivals ATCC 33277细菌生物膜的生物量与对照组无统计学差异(P>0.05)。当D-苯丙氨酸溶液浓度≥120mM时,P.gingivals ATCC 33277胞外多糖的产量具有统计学差异(P<0.05);当D-苯丙氨酸溶液浓度在0.16mM至80mM之间时,P.gingivals ATCC 33277胞外多糖的产量与对照组无统计学差异(P>0.05)。随着加入的D-苯丙氨酸溶液浓度的提高,P.gingivals ATCC 33277扫描电子显微镜下观察到的生物膜形态随之改变,从多层致密网状结构变为稀疏不成膜的单个细菌。随着加入的D-苯丙氨酸溶液浓度的提高,活死细菌染色下的P.gingivals ATCC 33277细菌量明显减少,且死菌比例增加。对应浓度的L-苯丙氨酸溶液与D-苯丙氨酸在生物膜量、细菌活性及生物膜形貌三个方面,对P.gingivals ATCC 33277具有相似的作用效果,L-苯丙氨酸抑制D-苯丙氨酸对胞外多糖含量的作用。结论:(1)D-苯丙氨酸浓度≥80mM时,对P.gingivals ATCC 33277生物膜的形成具有抑制作用。(2)D-苯丙氨酸浓度≥120mM时,可以减少P.gingivals ATCC 33277胞外多糖的产生。(3)L-苯丙氨酸在抑制P.gingival ATCC 33277生物膜的形成时,与对应浓度的D-苯丙氨酸具有相似的作用效果;L-苯丙氨酸抑制D-苯丙氨酸对胞外多糖含量的作用。