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目的:中枢神经系统神经元内在再生能力不足是导致受损神经元再生和功能恢复失败的主要原因。神经元损伤后多个细胞内信号通路之间协同调节的靶基因可显著促进神经元的存活,增强神经元的内在再生能力,使受损神经元长距离轴突再生、神经回路重建和功能恢复变成可能。因而,找准靶点基因提升受损中枢神经元的内在再生能力是治疗中枢神经损伤的关键所在。莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点(provirus integration site for Moloney murine leukemia virus,Pim-1)为原癌基因,可编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是许多细胞因子及生长因子细胞内信号通路的共同下游效应分子,通过磷酸化下游蛋白质丝氨酸/苏氨酸位点,在细胞增殖、存活及凋亡等过程中发挥重要作用。基于Pim-1是多个信号通路共同下游效应分子,且对细胞的增殖及存活具有重要作用,本研究首先观察Pim-1在体外受损中枢神经元样细胞内的表达变化,睫状神经营养因子(CNTF)和神经突起素(Neuritin,Nrn1)调控下游信号通路对Pim-1表达的影响,以及这种影响对受损神经元的作用及相关机制。以Pim-1基因为靶点,用重组慢病毒(recombinant lentivirus)载体过表达Pim-1,或用Pim-1 siliencer特异性干扰Pim-1表达,探讨直接调控Pim-1表达对体外受损神经元样细胞的活性和突起再生的作用,为临床治疗中枢神经元损伤提供新的方法及其实验和理论依据。本研究还基于长链非编码RNA(long non-coding RNA,Lnc RNA)调控神经发育和损伤的相关研究以及Lnc-Pim1与Pim-1基因位点、序列的密切关系,观测Lnc-Pim1在体外中枢神经元样细胞的序列全长、表达定位、损伤后表达变化、与Pim-1相互作用关系,并以Lnc-Pim1基因为靶点,用重组慢病毒载体过表达Lnc-Pim1,或用Lnc-Pim1siliencer特异性干扰Lnc-Pim1表达,探讨调控Lnc-Pim1表达对体外受损神经元样细胞的修复作用,同时还应用CHIRP-MS和RNA-seq技术探究Lnc-Pim1发挥作用的初步分子机制。方法:(1)在体外用20μmol/ml反式视黄酸(RA)将Neuro-2a细胞诱导成为神经元样细胞(N-2a-N);用50μmol/L去铁胺亚磺酸盐(DFO)抑制Neuro-2a细胞增殖;用1mmol/L丙烯酰胺(ACR)损伤N-2a-N细胞突起。N-2a-N细胞分为正常对照组、PBS组、300μg/L CNTF组、500μg/L Nrn1组。用Image J 6.0测量细胞突起长度,用CCK-8法检测细胞活性。免疫荧光细胞化学法检测N-2a-N细胞表型及Pim-1蛋白表达,Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在各组的表达变化。Western blotting检测调节Pim-1活性的相关信号转导分子(Stat-3、p-Stat-3、Erk1/2、p-Erk1/2),细胞存活、凋亡相关分子(Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)及轴突再生相关分子GAP-43的表达变化。(2)用RACE法获得N-2a-N细胞内Lnc-Pim1全长序列。用Phylo CSF、CPC和CNCI软件对Lnc-Pim1编码能力进行预测。用FISH法和核质分离技术检测Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内的亚细胞定位。用Real-time PCR检测不同时间点受损N-2a-N细胞中Lnc-Pim1的表达变化。(3)构建Pim-1、Lnc-Pim1重组慢病毒载体,用Real-time PCR测定病毒的滴度。(4)设计Pim-1、Lnc-Pim1特异性干扰试剂Pim-1 siliencer和Lnc-Pim1 siliencer,采用Real-time PCR检测不同浓度干扰试剂对N-2a-N细胞内Pim-1、Lnc-Pim1表达的影响。(5)用MOI值为40携带杀稻瘟菌素抗性的Pim-1重组慢病毒载体感染Neuro-2a细胞,用80μg/ml的杀稻瘟菌素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Pim-1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用200nmol/ml的阴性对照物(Negtive control,NC)silencer或Pim-1 siliencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Pim-1 silencer组,并于转染48 h后检测。倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,并对细胞突起长度进行测量、统计。用CCK-8检测各组细胞活性,用Real-time PCR及Western blotting检测各组Pim-1基因及蛋白的表达,用Western blotting检测各组GAP-43蛋白表达。(6)用MOI值为40携带嘌呤霉素抗性Lnc-Pim1的重组慢病毒感染Neuro-2a细胞,用20μg/ml的嘌呤霉素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Lnc-Pim1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Lnc-Pim1 silencer组,并于转染48 h后检测。用CCK-8法检测各组细胞活性,倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,用Image J对细胞突起长度进行测量、统计。用Real-time PCR检测Lnc-Pim1的表达,用Western blotting检测Erk1/2、p-Erk1/2的表达。(7)N-2a-N细胞用重组慢病毒载体分别过表达Pim-1和Lnc-Pim1,用200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer分别敲低Pim-1和Lnc-Pim1的表达,用Real-time PCR检测过表达或敲低Pim-1、Lnc-Pim1对彼此基因表达的影响。(8)用CHIRP-MS技术检测正常N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的互作蛋白,用RNA-seq技术检测正常N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达或敲低所导致的差异性表达基因,分别对互作蛋白和差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析。结果:(1)细胞免疫荧光显示N-2a-N细胞表达神经元标志分子β-ⅢTubulin和Neurofilament-200,Pim-1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质。50μmol/L DFO能有效抑制Neuro-2a细胞的增殖。用1mmol/L的ACR成功建立N-2a-N细胞突起损伤模型。N-2a-N细胞损伤后,Pim-1基因表达呈现先降低、后升高、再降低的趋势。与PBS组相比,CNTF组和Nrn1组最长神经突起所占比例明显增加,细胞内信号转导分子Erk1/2、p-Erk1/2、Stat3、p-Stat3、Pim-1表达上调,凋亡相关分子Cleaved Caspase-3、Bax表达下调,抗凋亡相关分子Bcl-2表达上调,神经突起生长相关分子GAP-43表达上调。(2)RACE法获得的N-2a-N细胞内Lnc-Pim1序列全长为2262个碱基;Phylo CSF、CPC和CNCI软件证实Lnc-Pim1具有较低的编码蛋白潜能;FISH法和核质分离技术证实Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内主要表达于细胞质,少部分表达在细胞核。N-2a-N细胞损伤后,Lnc-Pim1基因表达呈现出先降低、后升高、再降低的趋势,变化的时相点早于Pim-1。(3)成功构建LV-Pim-1和LV-Lnc-Pim1过表达载体,LV-Pim-1滴度为2.64×10~8TU/ml,LV-EGFP滴度为6.82×10~8TU/ml;LV-Lnc-Pim1滴度为3.65×10~8TU/ml,LV-mcherry滴度为1.18×10~9TU/ml。(4)200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml LV-Lnc-Pim1silencer可分别特异性干扰N-2a-N细胞内Pim-1和LV-Lnc-Pim1的表达。(5)MOI值为40的Pim-1重组慢病毒载体具有较高的感染率,且不影响Neuro-2a细胞活性;80μg/ml的杀稻瘟菌素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞。病毒感染的Neuro-2a细胞,经纯化5代后其感染率可达85%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Pim-1表达水平。Pim-1过表达可增强受损N-2a-N细胞的活力,上调GAP-43蛋白的表达,进而促进受损N-2a-N细胞突起再生。200nmol/ml Pim-1 silencer可导致N-2a-N细胞内Pim-1 m RNA和蛋白表达下调、细胞活性减弱、GAP-43蛋白表达下调,N-2a-N细胞突起的生长受到显著抑制。(6)MOI值为40的Lnc-Pim1重组慢病毒具有较高的感染率且不影响Neuro-2a细胞活性;20μg/ml的嘌呤霉素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞;病毒感染的Neuro-2a细胞经纯化5代后其感染率可达到90%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Lnc-Pim1表达水平。Lnc-Pim1过表达可激活Neuro-2a细胞Erk1/2信号通路,具有促进细胞分化的潜能,并能促进受损N-2a-N细胞突起再生。Lnc-Pim1silencer可敲低N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的表达,抑制N-2a-N细胞突起的生长,不影响细胞活性。(7)N-2a-N细胞Pim-1过表达导致Lnc-Pim1表达下调,Pim-1表达下调对Lnc-Pim1的表达无显著性影响;Lnc-Pim1过表达可促进Pim-1表达上调,Lnc-Pim1表达下调对Pim-1表达无显著影响。(8)CHIRP-MS共检测出N-2a-N细胞内183个Lnc-Pim1特异性的互作蛋白,GO和KEGG富集分析显示Lnc-Pim1特异性的互作蛋白主要分布在N-2a-N细胞的细胞质、少部分分布在细胞核。这些互作蛋白与N-2a-N细胞内基因和蛋白的表达调控、细胞间黏附、外泌体分泌、蛋白酶体活性、物质代谢等多种生物学过程相关。在这些互作蛋白中,Tubulin与Histone H2的可信度值最高。RNA-seq结果显示N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达导致140个差异表达的基因,其中93个表达上调,47个表达下调;N-2a-N细胞Lnc-Pim1敲低导致982个差异表达的基因,其中732个表达上调,250个表达下调。GO和KEGG富集分析显示MAPK和PI3K/Akt信号通路可能在Lnc-Pim1对N-2a-N细胞突起生长的效应中起重要作用。过表达和敲低Lnc-Pim1后,一些通路上共表达的Ccl2、Ccl5、Ghr、Hgf和Il1b基因可能是Lnc-Pim1作用的靶基因。结论:(1)Pim-1、Lnc-Pim1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1和Lnc-Pim1的需要。(2)神经营养因子CNTF、Nrn1可激活受损N-2a-N细胞Erk1/2及Stat3信号通路,上调Pim-1,进而增强细胞活性、减少细胞凋亡、上调GAP-43表达,从而促进受损N-2a-N细胞突起再生。(3)Pim-1过表达能够增强受损N-2a-N细胞活性、上调GAP-43表达,进而促进突起再生。敲低N-2a-N细胞Pim-1的表达,细胞活性、GAP-43表达和突起生长受到明显抑制。(4)Lnc-Pim1过表达可促进受损N-2a-N细胞突起再生,还可能具有促进Neuro-2a细胞分化的作用。Lnc-Pim1表达下调抑制N-2a-N细胞突起生长。(5)Lnc-Pim1过表达可能顺式增强Pim-1表达,Pim-1过表达可抑制Lnc-Pim1表达。(6)N-2a-N细胞中一些Lnc-Pim1的互作蛋白及受Lnc-Pim1调节的基因,为下一步研究Lnc-Pim1作用机制提供了初步实验基础。总之,N-2a-N细胞的Pim-1、Lnc-Pim1主要表达于细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1、Lnc-Pim1的需要;外源性CNTF或Nrn1经上调Pim-1表达以及Pim-1、Lnc-Pim1经重组LV载体过表达,均能促进受损N-2a-N细胞突起的再生,并初步阐明了一些相关作用机制。