背景:迷走神经是心房纤颤发生和维持的重要机制,去迷走神经消融是房颤消融领域的热点。虽然之前的研究表明能明显提高房颤消融的成功率、提高了房颤治疗率,但近期另一些研究不断涌现表明此种手术方式并无益处甚至有害。鉴于此,心脏迷走神经末梢释放突触前递质乙酰胆碱,通过G-蛋白激活内向整流钾电流(IK-Ach)可诱发房颤。我们前期研究发现,左心房局部注射Gαi2 C-terminal peptide(Gαi2ctp)可以干扰迷走神经活性,减少迷走介导的房颤的发生,但以肽段为基础的药物治疗需要肽段在心房肌细胞内持续而可控的表达,故其应用受到一定程度的制约。目的:本研究拟采用快速起搏建立的犬房颤模型,构建表达Gαi2ctp基因的载体,通过开胸局部注射的方法靶向转导至犬左心房,增加心房肌的表达量,干扰迷走神经活性,减少迷走神经介导的房颤的发生,并从电生理学、组织学、分子生物学等角度验证其疗效,明确基因靶向干预治疗的有效性及可行性,为房颤的基因治疗提供新的思路和理论依据。方法:1)构建Gαi2ctp重组腺病毒表达载体。利用293细胞包装扩增rAd-Gαi2ctp,获得大量含Gαi2ctp的重组腺病毒;用PCR法鉴定扩增的重组腺病毒;用荧光梯度稀释方法测定重组腺病毒rAd-Gαi2ctp滴度。在乳鼠心肌细胞中观察转染后最佳表达时间;在犬心房肌中进一步验证转染效果以及观察对肺、肝、肾的安全性;2)实验动物随机分为2组,经典的快速心房起搏致急性房颤组(n=6只):行左心耳快速起搏6小时。迷走介导型房颤组(n=7只):给予左心耳快速起搏术,同时加右侧迷走神经阈上刺激6小时。测定两组犬心房和肺静脉各部位ERP变化、MAP变化、房颤诱发率;观察心房组织HE染色变化、MASSON染色变化、PAS染色变化,进一步电镜观察心肌组织病理组织和超微结构改变。免疫组化观察心房神经丛TH、CHAT的变化,验证迷走介导型急性房颤模型的可实施性;3)实验动物随机分为3组。①假手术组(A组,n=5只):经胸心房肌注射500μl生理盐水;②rAd-EGFP+房颤组(B组,n=6只):经胸心房肌内注射500μl携带EGFP(绿色荧光蛋白)基因的重组腺病毒溶液。③rAd-Gαi2ctp+房颤组(c组,n=6只):经胸心房肌内注射500μl携带gαi2ctp基因的重组腺病毒溶液。三组均在7天后制作急性房颤模型。检测三组犬在体左、右心房电生理指标的变化;观察三组犬左右心房离体mea电传导图变化;实验结束后收取心房肌行he染色、pas染色检测;取右上神经节丛行免疫组化半定量检测th、chat的表达;采用westernblot的方法测定心房和肺静脉不同部位gαi2ctp的蛋白质水平的表达情况;证实gαi2ctp对急性迷走神经介导型房颤治疗的效果;4)实验动物随机分为3组。①假手术+房颤组(a组,n=6只):开胸关胸假手术,术后7天制作急性房颤模型;②rad-gαi2ctp+房颤组(b组,n=7只):经胸心房肌内注射500μl携带egfp(绿色荧光蛋白)基因的重组腺病毒溶液7天后制作急性房颤模型;③去迷走神经消融+房颤组(c组,n=6只):去迷走神经消融术后7天制作急性房颤模型。检测犬心肌组织电生理参数的改变。对比gαi2ctp基因治疗和经典去迷走神经消融手术对急性迷走神经介导型房颤的效果。结果:1)293细胞包装扩增rad-gαi2ctp,获得大量含gαi2ctp的腺病毒,扩增后病毒滴度为1×1011pfu/ml;在乳鼠心肌细胞转染后最佳表达时间为5-7天,10天后逐渐消失;对犬经胸心房肌注射rad-gαi2ctp基因转染后,左、右心房冰冻切片均显示大量绿色荧光蛋白表达,呈强阳性,主要脏器肺脏,肝脏,肾脏冰冻切片均显示少量绿色荧光蛋白表达,呈弱阳性。肺肝肾亲和性强,但表达较心肌少,安全性适中;2)两组房颤组在起搏1h,3h,6h后erp与基线水平相比,erp明显缩短(p<0.05);两组组间各时间点比较:rap+vns组与rap组比较,erp明显缩短(p<0.05)。两组心房肌map随时间延长,出现apd90缩短的明显趋势。两组房颤诱发率以rap+vns组为最高,6h急性房颤模型成功率达到100%。he染色病理组织变化:两组心房肌组织心肌细胞排列紊乱,拉长呈波纹状;masson染色显示两组心肌纤维之间连接组织积聚,心肌细胞之间的间隔增宽;pas染色显示两组糖原累积明显,以rap+vns组为显著。两组心房肌神经丛rap+vns组th、chat均表达多于rap组;3)三组两两比较,b组erp和fapd变化分别与a组和c组比较差异有统计学意义,a组和c组比较差异无统计学意义。各组组内比较,a组假手术组和c组gαi2ctp基因组每小时末电生理指标和基线水平比较,差异无统计学意义。b组空载基因房颤组每小时末电生理指标和基线水平比较,差异有统计学意义。观察三组犬左右心房离体mea电传导图变化:b组显示传导紊乱,a组和c组明显传导未见异常。心房肌pas染色发现a组与b组和c组比较差异有统计学意义。三组右上神经节丛行免疫组化半定量检测发现th、chat的表达以b组和c组为多;westernblot检测显示犬心房gαi2ctp表达:三组比较差异有统计学意义,c组可见犬左心房gαi2ctp蛋白表达增多;4)3组肺静脉和心房各部位erp值比较:组a分别与组b和组c比较差异有统计学意义;各组组内比较:a组erp在各时间段随着时间的延长显著缩短(p<0.05)。B组和C组在起搏1小时、3小时、6小时与基线水平比较,ERP均未见明显改变(P>0.05)。3组左、右心房MAP90值比较结果同ERP:各组组内比较:A组MAP90在各时间段随着时间的延长显著缩短(P<0.05)。B组和C组在起搏1小时,3小时,6小时和基线水平MAP90比较未见明显改变(P>0.05);三组心房肌行免疫组化半定量检测发现TH、CHAT的表达以A组为多。结论:1)成功构建Gαi2ctp重组腺病毒表达载体。确定了最佳转染时间和对其他脏器的安全性;2)成功建立犬RAP+VNS模型,此模型能模拟迷走介导型房颤发生早期的电生理改变,稳定可靠,重复性好。模型与临床房颤相似,具有电生理和自主神经功能两方面的异常;3)重组腺病毒转导Gαi2ctp使其在心肌细胞内过表达,活性增加,可致Gαi2ctp蛋白上调,进而改变心肌电生理特性,引起心房和肺静脉各部位ERP和左、右心房MAP90延长,逆转电重构的发生发展,减少心律失常的发生;4)重组腺病毒转导Gαi2ctp基因和消融迷走神经手术两者差异并不明显,两者均能抑制迷走神经介导型房颤的发生。