研究背景和研究目的内耳毛细胞是听觉的受体细胞,能够将机械刺激转化为电信号,对于维持听觉有着不可替代的作用。毛细胞表面的微绒毛样突起——听纤毛在机械能-电能的转换过程中发挥了至关重要的作用。听纤毛的根部嵌插在毛细胞的表皮板中。表皮板位于毛细胞胞质上表面,是由纤维肌动蛋白（F-actin）构成的一个电子致密结构,能够使听纤毛稳定地锚定在毛细胞上。听纤毛和表皮板的发育和维持对听觉传导有着非常重要的意义。组成听纤毛的蛋白主要是纤维肌动蛋白（F-actin）。虽然发育成熟的听纤毛的高度是保持不变的,但是组成听纤毛的F-actin不断地进行自我更新：新的肌动蛋白单体从听纤毛的顶部加入,旧的肌动蛋白单体从根部解离。在听纤毛的发育过程中,肌动蛋白单体的加入速度大于解离速度,从而使听纤毛长度增加。待发育成熟后,肌动蛋白单体的加入速度与解离速度相当,从而使听纤毛维持在一定的高度。除了F-actin外,还有很多其他蛋白定位在听纤毛的不同位置,如Myo15a、 Whiriin、Twinfilin2等,参与维持听纤毛的稳定,在听觉传导过程中发挥重要作用。听纤毛的发育和维持是一个非常复杂的过程,在这一过程中如果发生异常就会使听纤毛结构发生破坏,从而导致综合征性或非综合征性耳聋,严重影响患者的生活质量。目前,我们对听纤毛发育和维持的分子机制还不清楚,很多参与这个过程的听纤毛蛋白还有待发现,这些都阻碍了我们在临床上为耳聋诊治提供帮助。在本研究中,我们发现FCHSD1和FCHSD2在小鼠内耳听毛细胞中表达,其中FCHSD1定位在听纤毛和表皮板上,而FCHSD2沿听纤毛呈点状分布。FCHSD1和FCHSD2是果蝇Nervous Wreck（Nwk）在哺乳动物中的两个同源蛋白,属于PCH蛋白家族。这个家族的蛋白普遍参与调节细胞膜和细胞骨架的相互作用,并且参与调节F-actin的聚合过程。而听纤毛和表皮板的蛋白组成主要是F-actin,因此,我们推测FCHSD1和FCHSD2很可能在听纤毛或者表皮板的发育和维持过程中发挥重要的功能。虽然Fchsdl和Fchsd2基因序列在几年前就已经被发现,但是FCHSD1和FCHSD2的生物学功能还不清楚,并且FCHSD1和FCHSD2的生物学功能是否存在分工还需要进一步探讨。本论文的研究不仅可以帮助我们认识FCHSD1和FCHSD2的生物学功能,而且有助于了解听纤毛和表皮板的发育和维持的分子机制,从而对治疗与听觉相关的疾病提供理论依据。研究内容1、检测Fchsdl和Fchsd2在小鼠不同组织中的表达情况。2、检测FCHSD1或FCHSD2在细胞或小鼠内耳听毛细胞中的表达定位情况。3、鉴定与FCHSD1或FCHSD2相互作用的蛋白。4、研究FCHSD1和FCHSD2的细胞生物学功能,包括FCHSD1、FCHSD2与不同种类磷脂的结合能力,以及在纤维肌动蛋白（F-actin）聚合过程中的调节能力等。5、建立基因敲除小鼠模型,研究FCHSD1和FCHSD2在听觉传导中的生理功能。研究方法1、Fchsdl和Fchsd2在小鼠不同组织中表达情况的检测1)提取小鼠不同组织的mRNA;2)利用RT-PCR检测Fchsdl和Fchsd2在小鼠不同组织中的表达情况。2、FCHSD1或FCHSD2在COS7细胞中定位情况的检测1)把小鼠FCHSD1和FCHSD2的基因编码序列分别构建到pEGFP-C2载体中；2)将构建的质粒转染入COS7细胞系中,利用激光扫描共聚焦显微镜检测其细胞中的定位情况。3、FCHSD1或FCHSD2在小鼠内耳听毛细胞中的定位情况的检测。1)剖离小鼠耳蜗,将其基底膜取出；2)利用整封染色方法,对耳蜗基底膜孵育相应的抗体；3)然后利用激光扫描共聚焦显微镜检测FCHSD1以及FCHSD2在内耳听毛细胞中的定位情况。4、与FCHSD1或FCHSD2相互作用蛋白的筛选与鉴定1)利用酵母双杂交筛选与FCHSD1或FCHSD2的相互作用蛋白；2)利用免疫共沉淀实验检测蛋白之间的相互作用。5、FCHSD1和FCHSD2在体外与不同种类磷脂结合能力的检测1)构建表达质粒,把编码FCHSD1ΔC和FCHSD2ΔC的基因序列构建到pGEX-4T-2载体中；2)在大肠杆菌BL-21中用适宜浓度的IPTG诱导表达融合蛋白；3)诱导表达的GST融合蛋白,利用Sepharose 4B柱亲和层析纯化,然后利用分子筛进一步纯化；4)利用PIP strips检测膜（蛋白与磷脂酰肌醇相互作用检测膜）检测FCHSD1或FCHSD2在体外对磷脂的结合能力。6、FCHSD1和FCHSD2在体外对F-actin聚合过程的调控作用的检测1)构建相关表达质粒,把编码FCHSD1ΔC和FCHSD2ΔC以及相关F-actin组装调节蛋白（例如WASP、Arp2/3）的基因序列构建到pGEX-4T-2（或pET-28a）载体中；2)在大肠杆菌BL-21中用适宜浓度的IPTG诱导表达融合蛋白；3)诱导表达的融合蛋白利用Sepharose 4B柱（或Ni-NTA柱）进行纯化,然后利用分子筛或离子交换色谱进一步纯化；4)在体外检测FCHSD1和FCHSD2对依赖于WASP-Arp2/3的F-actin聚合过程的调节作用。7、检测稳定表达MYC-FCHSD1或MYC-SNX9的COS7细胞的细胞增殖情况1)利用适宜浓度的G418筛选稳定表达MYC-FCHSD1或MYC-SNX9的COS7细胞株；2)利用MTT法检测稳定表达MYC-FCHSD1或MYC-SNX9的COS7细胞株的细胞增殖情况。8. FCHSD1和FCHSD2基因敲除载体的构建1)PCR扩增用于基因同源重组的长臂和短臂DNA片段；2)将同源重组的长臂和短臂DNA片段顺序连入敲除载体中；3)利用电转的方法将线性化的含有Fchsdl和Fchsd2基因敲除载体转染入小鼠胚胎干细胞中；4)筛选发生正确同源重组的ES细胞。研究结果1、小鼠FCHSD2与果蝇Nwk的同源度比FCHSD1局通过对比小鼠FCHSD1和FCHSD2及其在果蝇中的同源蛋白Nwk的主要功能域的氨基酸序列,我们发现FCHSD2的F-BAR结构域与Nwk的F-BAR结构域同源度为41%,而FCHSD1的F-BAR结构域与Nwk的F-BAR结构域同源度仅有28%。然而,FCHSD1和FCHSD2两个SH3结构域与Nwk的SH3结构域的同源度相差不大,除此之外FCHSD2的C末端比FCHSD1的C末端多出约60个氨基酸,与Nwk的氨基酸组成数目接近（图1-1）。2、FCHSD2在小鼠不同组织中广泛表达,而FCHSD1主要分布在小鼠神经系统中1) RT-PCR检测结果表明,Fchsdl主要在小鼠的螺旋神经节和大脑皮层中高表达,而Fchsd2表达更加广泛,在小鼠的柯替氏器、椭圆囊、螺旋神经节、舌、眼睛、大脑、小脑、肝脏等组织中均能够被检测到（图1-2）。2) Western blot检测结果表明,FCHSD1和FCHSD2在小鼠的耳蜗和前庭器官中都能够被检测到（图1-3）。3、在小鼠听毛细胞中FCHSD1主要定位在听纤毛和表皮板上,而FCHSD2沿着听纤毛呈点状分布利用整封染色检测FCHSD1和FCHSD2在小鼠听毛细胞中的定位,结果显示,FCHSD1主要定位在听毛细胞的表皮板上,在听纤毛上也有荧光信号（图1-4A,B）,而FCHSD2沿着整根听纤毛呈点状分布（图1-4C,D）。4、EGFP-FCHSD1或EGFP-FCHSD2在COS7细胞中的定位相似利用激光扫描共聚焦显微镜检测EGFP-FCHSD1、EGFP-FCHSD2在COS7细胞系中的定位情况,结果表明EGFP-FCHSD1和EGFP-FCHSD2分布在COS7细胞的细胞质中,EGFP-FCHSD1在胞质中的分布更加均匀并且表达量普遍高于EGFP-FCHSD2,而EGFP-FCHSD2在接近细胞核的周围荧光信号要强于胞质中央的部位（图2-1）。5、FCHSD1和FCHSD2有不同的相互作用蛋白1)我们利用酵母双杂交系统筛选到了与FCHSD1的相互作用蛋白,包括SNX9、ITSN1、ITSN2等（图2-3）。FCHSD2有自激活效应,因此不能用酵母双杂交实验筛选与其相互作用的蛋白。2) Western blot实验结果显示FCHSD1能够与FCHSD1、FCHSD2、SNX9相互作用,而FCHSD2除了与FCHSD1、FCHSD2相互作用外还能够与WASP、 N-WASP等蛋白相互作用,但是不能够与SNX9发生相互作用（图2-2和图2-4A）。6、FCHSD1的F-BAR结构域以及SNX9的SH3结构域介导了FCHSD1与SNX9之间的相互作用根据FCHSD1和SNX9的蛋白结构域的组成情况,分别将FCHSD1分成2个部分,SNX9分成3个部分（图2-4B）,然后利用免疫共沉淀的方法分别检测发挥作用的蛋白结构域,结果显示FCHSD1的F-BAR结构域以及SNX9的SH3结构域介导了FCHSD1与SNX9之间的相互作用（图2-4C,D）。7、SNX9在小鼠内耳中表达,并且与FCHSD1共定位在小鼠听毛细胞的表皮板中1) Western blot实验结果检测到SNX9在小鼠耳蜗、前庭器官中表达（图2-5）。2)整封染色实验结果表明SNX9特异性的定位在小鼠听毛细胞的表皮板上,并且与FCHSD1共定位（图2-6）。8、在体外,FCHSD1和FCHSD2结合磷脂的种类相同1)在大肠杆菌BL-21中,利用IPTG诱导表达融合蛋白GST-FCHSD1ΔC、 GST-FCHSD2ΔC以及GST,利用GST亲和层析纯化蛋白,然后用western blot检测蛋白的表达情况,结果如图3-1A所示。2)磷脂结合实验结果显示,FCHSD1和FCHSD2都能够与PtdIns（3） P、PtdIns（5）P、PS结合（图3-2）。9、在体外,FCHSD1、FCHSD2对依赖于WASP-Arp2/3的F-actin聚合过程的调节方式不同1)体外诱导融合蛋白GST、GST-FCHSD1ΔC、GST-FCHSD2ΔC、GST-SNX9和His-hWASP145的表达,经纯化后得到的蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳进行检测（图3-1B）。2)虽然FCHSD1自身对F-actin聚合没有影响,但可以大大增强SNX9对F-actin聚合的促进能力（图3-3A,B）。3) FCHSD2对依赖于WASP-Arp2/3的F-actin聚合有促进作用,但与SNX9没有协同作用（图3-3）。10、MYC-FCHSD1或MYC-SNX9能够抑制COS7细胞的生长1)利用G418（终浓度为500μg/ml）筛选稳定表达MYC-FCHSD1或MYC-SNX9的COS7细胞株,得到一个稳定表达MYC-FCHSD1的细胞株,以及两个稳定表达MYC-SNX9的细胞株,编号分别是MYC-SNX9-3以及MYC-SNX9-15（图3-4）。2)利用MTT方法检测稳定表达MYC-FCHSD1或MYC-SNX9的COS7细胞株的增殖情况,结果显示,稳定表达MYC-FCHSD1或MYC-SNX9的COS7细胞生长速度减慢。其中,与对照组相比,稳定表达MYC-FCHSD1、 MYC-SNX9-15的COS7细胞在培养24小时后细胞生长有明显的抑制现象,稳定表达MYC-SNX9-3的COS7细胞在培养72小时后出现明显的细胞生长抑制现象（图3-5）。11、FCHSD1和FCHSD2基因敲除载体的构建1) FCHSD1基因敲除载体的构建和鉴定从小鼠ES细胞基因组DNA中扩增FCHSD1基因同源重组所需的长臂片（5062bp）和短臂片段（2082bp）,分别将FCHSD1的同源臂DNA片段连入pKO-NTKV 1901载体中（图4-1）。发生同源重组后,FCHSD1基因的第一个至第六个外显子共5226bp的DNA将被新霉素抗性基因（Neo）的DNA序列替代。2) FCHSD2基因敲除载体的构建和鉴定从小鼠ES细胞基因组DNA中扩增FCHSD2基因同源重组所需的长臂（4271bp）和短臂片段（1914bp）,分别将FCHSD2的同源臂DNA片段连入pKO-NTKV 1901载体中（图4-2）。发生同源重组后,FCHSD2包括第一个外显子在内的上游基因（19532bp）将被新霉素抗性基因（Neo）的DNA序列替代。结论1、与果蝇中同源蛋白Nwk相比,FCHSD2在蛋白结构上比FCHSD1更加保守。此外,与Nwk的相互作用蛋白,例如WASP、N-WASP,也能够与FCHSD2相互作用,但是不与FCHSD1发生相互作用,这说明FCHSD2与Nwk的生物学功能可能更加相近。2、FCHSD1与FCHSD2在小鼠不同组织中的表达存在差异,Fchsdl主要在小鼠的神经组织中高表达,而Fchsd2在小鼠的不同组织中广泛表达。3、FCHSD1和FCHSD2在小鼠听毛细胞中表达,可能在听纤毛和表皮板发育或维持中发挥重要作用。4、在体外,FCHSD1和FCHSD2与相同种类的磷脂结合。5、FCHSD1和FCHSD2对WASP-Arp2/3介导的F-actin聚合过程的调节机制不同,前者通过SNX9间接调控F-actin聚合,后者则可以直接调控F-actin聚合。6. MYC-FCHSD1或MYC-SNX9能够抑制COS7细胞的生长。