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第一部分:猪FIT1基因表达模式与调控机理的研究FIT蛋白家族在机体内脂肪的存储过程中,特别是对细胞内甘油三酯脂滴的形成中发挥着必不可少的作用,人、小鼠和猪FIT1基因均在肌肉组织中表达,具有组织特异性,而肌肉中的甘油三酯的含量是影响猪肉风味和肉质品质的重要因素,为了更好地理解FIT1基因与肌肉生长发育以及品质性状的相关性,本研究主要针对FIT1基因的表达模式以及其转录调控机理进行了研究,主要结果如下:1.利用实时定量RT-PCR技术对猪FIT1基因在4月龄大白猪16种不同组织中的表达模式进行了分析,结果显示FIT1基因仅在心肌和骨骼肌中高表达,展现出了较高的肌肉组织特异性表达模式;对猪FIT1基因在4个不同发育时期的背最长肌组织以及不同分化时期的C2C12细胞中的表达模式进行了分析,发现FIT1基因在胚胎期表达量最低,在出生后4月龄时表达量达到了最大值;FIT1基因的表达量随着C2C12细胞分化的过程急剧增加。2.成功分离克隆了猪FIT1基因5’端上游1040bp(-1037/+3)的调控序列,通过比对不同物种之间近端启动子区序列发现存在两个在猪、人、小鼠以及大鼠中保守的E-box元件。对FIT1基因5’端上游调控序列构建了不同长度的缺失片段,并通过双荧光素酶活性分析将核心启动子区定位于-397/+3bp片段,并发现FIT1基因启动子片段在非肌源性的C3H10 1/2细胞以及PK细胞中都没有转录活性,在未分化的C2C12细胞中转录活性也是相当低,而只有在分化的C2C12细胞中才表现出较强的启动子活性。3.对FIT1基因核心启动区物种间保守的E-box元件附近序列进行缺失,并通过双荧光素酶活性分析发现包含两个保守E-box元件的-245/+3bp片段对驱动FIT1基因启动子活性是必需的;进一步对-245/+3bp区域内两个E-box位点进行了定点突变验证,表明任何一个E-box元件的突变都能超显著降低启动子活性(P<0.001),而E-box1(CACCTG)序列在驱动FIT1基因启动子活性中发挥着主导作用。4.为了验证转录因子MyoD对FIT1基因的转录调控作用,利用真核超表达载体对MyoD1进行超表达验证,表明超表达转录因子MyoD1能够显著增加FIT1基因启动子片段的转录活性;利用siRNA干扰片段对MyoD1进行干扰验证,得出MyoD1特异siRNA片段能够显著降低FIT1基因启动子片段的转录活性。5.通过ChIP实验在细胞内水平上验证了转录因子MyoD1与核心启动子区Ebox元件的结合情况,利用普通PCR以及实时定量RT-PCR检测后发现转录因子MyoD1能够分别同两个E-box元件结合,但其中MyoD1与E-box1元件的结合能力远大于E-box2,因此可以得出转录因子MyoD1主要是通过与核心启动子区保守的E-box1元件相结合以驱动FIT1基因启动子的转录。第二部分:重复序列与肌肉疾病FSHD的关联分析面肩肱型肌营养不良病(FSHD)是由位于4q末端的D4Z4重复片段的缺失引起的表观遗传学调控失去抑制的一种常染色体显性遗传病,产生对细胞有毒性的DUX4-fl mRNA和DUX4蛋白,该基因在正常细胞中是不表达的。由于该病在婴儿和成年个体中的发病率均很高,因此寻找有效的治疗靶标至关重要。本部分研究主要寻找DUX4的靶向非编码RNA,主要结果如下:1.根据报道过的ChIP-seq和RNA-seq结果,选取11个DUX4的靶向重复序列(hsat2、L1MC4、L1P4b、LTR12D、LTR13、MER50B、MER52D、MER41G、MER72、MLT2A1和MLT2D)在FSHD细胞(17Abic和07Abic)和正常细胞(17Ubic和07Ubic)中在转录水平上进行了定量分析。结果证明了在分化的17Abic细胞中除MLT2A1和MLT2D外的其它重复性的RNA序列均被激活。而在分化的07Abic细胞中,除MLT2A1、hsat2和MER52D外的其它重复序列也均被激活。2.扩增hsat2和MLT2D的保守性序列,并克隆到慢病毒载体中,然后在293T细胞中包装成成熟的慢病毒颗粒。通过提取转染有上述慢病毒颗粒的17Ubic细胞的RNA来进行RNA-seq测序。根据测序结果选取了与FSHD相关的基因,包括ANO5、ATP2A1、CALCRL、CLYBL、CYP39A1、DAG1、FAM149A、GAD1、IL32、PDLIM3、TLR3和CCNA1等进行验证。qRT-PCR的结果表明,这两种非编码RNA均能显著降低ANO5、CLYBL、FAM149A、PDLIM3和IL32的表达水平。因此,可以得到,DUX4的靶向RNA重复序列均是潜在的与FSHD相关的非编码RNA。3.通过qRT-PCR的方法,检测了上述FSHD相关基因在正常的和转染有对照慢病毒颗粒的细胞中的表达情况。结果证实了不含任何插入片段的慢病毒颗粒对FSHD相关基因没有影响。