透明质酸修饰牛奶外泌体载药体系的研究

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外泌体是由细胞膜衍生的纳米囊泡(30-150 nm),它可将蛋白质、核酸和脂质等生物分子运输到受体细胞中,因此被认为是细胞间通讯的重要工具。由于具有高生物相容性、循环稳定性和低免疫原性等优势,外泌体已经成为癌症治疗中药物和基因递送载体的理想候选。然而,当前外泌体主要提取自细胞培养液,其制备过程繁琐、成本昂贵。此外,天然外泌体作为纳米载体缺乏足够的靶向性,无法将药物特异递送到肿瘤部位。为克服上述缺陷,本论文选取经济易得的牛奶作为外泌体来源,并通过等电点沉淀等简单手段从中分离得到牛奶外泌体(milk exosome,mExo)。同时,通过化学方法合成可修饰mExo的透明质酸(hyaluronan,HA)缀合物DSPE-PEG2000-HA,分别选取阿霉素(Doxorubicin,Dox)和抑癌基因miRNA204,构建了两种具备CD44特异性靶向能力的mExo载药体系,并在随后的细胞实验中证实了纳米载药体系HA-mExo-Dox和基因运输体系HA-mExo-miRNA204的靶向递送能力和抗肿瘤活性。主要结论如下:(1)利用等电点沉淀法和超高速离心,从牛奶中获得具有膜结构且形态完整的mExo,其水合粒径主要分布在123.9 nm处,Zeta电位为-4.24 mV。(2)构建纳米载药体系HA-mExo-Dox,并在形态观察、稳定性及体外释放等方面验证了其良好的纳米载体特征;荧光显微镜观察及流式细胞分析评估HA-mExo-Dox的药物递送水平,结果表明HA-mExo-Dox具有高效靶向递送Dox至肿瘤细胞的能力;对其抗肿瘤活性进行评估,结果显示在相同条件下,HA-mExo-Dox对CD44高表达MDA-MB-231、MCF-7和A549细胞的杀伤能力分别是游离Dox的1.7、1.3和3.7倍。(3)构建基因运输体系HA-mExo-miRNA204,并在形态观察、粒径分布及储存稳定性等方面验证了其良好的纳米载体特性;细胞荧光观察发现HA-mExo-miRNA204具有特异性递送miRNA204至CD44高表达肿瘤细胞的能力;胞内荧光定量分析结果显示HA-mExo-mi RNA204可将MDA-MB-231、MCF-7和A549细胞中miRNA204的含量分别提高20.3、10.7和9.3倍;体外细胞增殖实验表明,HA-mExo-mi RNA204对MDA-MB-231、MCF-7和A549细胞的增殖抑制率可分别达到42.9%、35.0%和21.1%。
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